冷冻切片方法及注意事项

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时间:2018-02-26

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1、一、实验前准备清理实验台及仪器。开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度(-15~-20℃*)。准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。二、取材解剖之后迅速取出所需的新鲜组织,用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材(24×24×2mm*),以防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡,使细胞内结构移位。(注:取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性,应避免不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm,厚者冰冻费时,大者难以切完整。甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。)三、冷冻切片1、取出组织支承器

2、,放平摆好组织,周边滴上包埋剂,速放于冷冻台上冰冻,用吸热器压住组织,至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片(1~3分种)。2、将冷冻好的组织块,夹紧于切片机持承器上,启动粗进退键,转动旋钮,将组织修平。3、调好欲切的厚度,根据不同的组织而定,原则上是细胞密集的薄切,纤维多细胞稀的可稍为厚切,一般在5~10μm间。4、调好防卷板。制作冰冻切片,关键在于防卷板的调节上,这就要求操作者要细心,准确地将其调较好,调校至适当的位置。切片时,以切出完整、平滑的切片为准。切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带,可避免组织摊片过程中皱折,保证组织结构的完整及切片的美观。注:①包埋剂

3、的选用:包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素,包埋剂用量要适宜,过多或过少都会影响标本冷冻质量。常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。(OCT包埋剂骤冷时固化,其冷冻速度和软硬韧度与组织相近,其还具有水溶性,不影响染色等优点。)②组织块过小:先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,组织周围再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。③冷冻箱及冷冻头的温度高低,要根据不同的组织而定。温度过低会导致组织块过硬,切片碎裂,

4、出现梯田状薄厚不均或空洞;反之,温度过高,组织块硬度不够,切片不易成形或成皱褶。数据图1供参考。④当切片时,如果发现冰冻过度时,可将冰冻的组织连同支承器取出来,在室温停留片刻,再行切片,或者用口中哈气,或者用大拇指按压组织块,以此来软化组织,再行切片。另者,调高冰冻点。⑤用于附贴切片的载玻片,不能存放于冷冻处,于室温存放即可。因为当附贴切片时,从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差,当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时,由于两种物质间温度的差别,当它们碰撞在一起时,分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力,使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片,由于温

5、度相同,没有发生上述的现象。四、常用冰冻切片苏木精—伊红染色染色步骤:1、冰冻切片用10%甲醛固定1~5分钟,流水冲洗2分钟,蒸馏水浸洗3分钟。2、苏木精1~2分钟。自来水快洗。3、0.5%盐酸乙醇分色1~2秒。蒸馏水快洗。4、0.25%~0.5%氨水蓝化,几秒种或至组织变蓝,自来水洗30秒~1分钟。光镜下检查细胞核分色程度。5、1%伊红1分钟。蒸馏水快洗。6、80%、90%、95%乙醇速洗,每级数秒到十几秒。光镜下监控细胞核与细胞质量颜色对比。7、100%乙醇2次,每次1~2分钟。8、二甲苯2次,每次1~2分钟。中性树胶封固。注:①结束阶段的二甲苯作用为透明,其目的是增强标本的折光率

6、,达到光镜下清晰观察染色结果。标本内若含水分可降低其折光率,导致光镜观察细微结构不清楚的结果。另二甲苯透明后有得于组织细胞的长久保存。②HE染色的水洗:整个染色过程中共5处涉及到水洗,但其洗涤程度及作用均有所不同。苏木精染色前的水洗为蒸馏水浸洗:切忌自来水替代蒸馏水浸洗,否则苏木精染液由弱酸性(棕红色)转变为弱碱性(蓝色),导致“有色沉淀”出现与积累,致使染色结果为黑蓝色。苏木精染色后的水洗为自来水洗,伊红染色后的水洗为蒸馏水快洗,作用是洗去未与组织相结合的染料成分,即洗去“浮色”。伊红染液为水溶性溶液,浸洗时间长会使组织的伊红颜色减退。分色后的水洗为自来水快洗,目的是终止分色液(0.

7、5%盐酸乙醇)对组织细胞的分色作用。过度分色将致使染色强度减弱,影响苏木精与伊红颜色的匹配。蓝化后的水洗为自来水冲洗,洗掉组织中多余的碱性成分(淡氨水),为伊红染色提供适宜的染色环境。五、冰冻切片的快速染色法①切片固定30秒-1分钟。②水洗(10秒)。③染苏木素3-5分钟。自来水冲洗片刻。(在组织上加苏木精染液数滴,放在漂片机上的烤板上加热一分钟。染液不能干)④分化(1%酸乙醇分化)。⑤于碱水(氨水)中返蓝20秒。⑥伊红染色10-20秒。⑦脱水

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