单克隆抗体与基因工程抗体制备技术

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1、第四章　单克隆抗体与基因工程抗体制备技术本章考点　　1.概念　　2.杂交瘤技术基本原理　　3.杂交瘤抗体的制备技术　　4.基因工程抗体　　　　由杂交瘤细胞产生的针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。其理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、且来源容易。　　传统的方法是将抗原注入动物，由动物体内B细胞产生的抗体。由于多数天然的抗原分子具有多种抗原决定簇，每一种决定簇可激活具有相应抗原受体的B细胞产生针对某一抗原决定簇的抗体。因此，将抗原注入机体后，刺激多个B细胞克隆所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，故称为多克隆抗体（PoAb）。　　第一节　杂交瘤

2、技术基本原理　　　　单克隆是指利用在细胞融合基础上的B细胞杂交瘤技术。　　杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（B淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。　　一、B细胞杂交瘤技术　　1.细胞的选择和融合：杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异性的单克隆抗体，

3、所以融合一方必须是经过抗原免疫的B细胞，通常选用被免疫动物的脾细胞，脾淋巴细胞的主要特征是抗体分泌功能。融合细胞另一方则要求在培养条件下的永生性，只有肿瘤细胞才是具备这一条件，所以选择同一体系的骨髓瘤细胞，因多发性骨髓瘤是B细胞系恶性肿瘤，其特点是稳定易培养、自身不分泌免疫球蛋白及细胞因子、融合率高、是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾细胞融合对象。　　2.选择培养基的应用：细胞融合的选择培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（H）、氨甲蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字头称为HAT培养基。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷是细胞DNA合成的途径；氨甲蝶呤（A）是叶

4、酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合作用的瘤细胞是经毒性培养基选取出的缺乏HGPRT细胞株，不能在该培养基上生长，只有融合细胞具有亲代双方遗传性能，才能在HAT培养基上长期存活与繁殖。　　3.有限稀释与抗原特异性的选择：细胞融合是一个随机的过程，需在融合细胞抗体筛选的基础上进行特异性筛选。将融合细胞进行充分稀释，进行克隆化处理，再将阳性细胞进行再次克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株进行增殖，再进行冰冻，体外培养或动物腹腔接种。　　　　　　图13杂交瘤技术操作主要流程示意图　　二、T细胞杂交瘤　　T细胞杂交瘤可分为小鼠细胞杂交瘤和人T

5、细胞杂交瘤。　　其基本过程是将激活的细胞与酶缺陷型淋巴瘤细胞融合，通过有限克隆稀释，获得特异性表达细胞受体（TCR）或其他功能的杂交瘤细胞。其主要步骤为：　　1.淋巴瘤细胞系的选择　要求有以下特征：　　（1）体外能无限、快速生长。　　（2）融合率高。　　（3）不分泌淋巴因子和杀伤功能。　　（4）缺乏某一特异性的细胞表面抗原或受体。　　（5）HGPRT酶缺陷型。　　2.特异性细胞的制备与活化：主要有可溶性抗原诱导激活的细胞、同种反应性细胞、人的特异性细胞等。　　3.T细胞杂交瘤的筛选。　　三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养　　杂交瘤细胞形成后的初期很不稳定，为确保单克隆抗体的专一性及避免其他

6、阴性细胞对其生长影响，必须将阳性杂交瘤细胞进行单细胞分离培养，产生单克隆杂交瘤细胞，经2～3次检测均为阳性的杂交瘤单个细胞，才能进行克隆化培养。　　克隆化培养后的阳性杂交瘤细胞应及时冻存，最好保存在-196℃液氮中。　　第二节　单克隆抗体的制备技术　　　　利用杂交瘤技术制备McAb基本原理是根据三个原则：（1）淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说；（2）杂交瘤细胞保持双方亲代细胞特性化；（3）然后大量培养增殖，制备所需的McAb。　　一、单克隆抗体的产生　　1.动物体内诱生方法：目前McAb治疗用或体外诊断用的多数尚采用这一方法制备。先在小鼠腹腔注射液体石蜡或福氏不完全佐剂，一周后将杂交瘤细

7、胞悬液注射腹腔，l～2周后，无菌抽取腹水，离心取上清液即可。　　2.体外培养法：这是实验室制备的方法。将杂交瘤细胞置培养瓶中培养，待培养液颜色改变或细胞过多开始死亡时，收集上清液，离心去掉碎片及细胞即可。另一种是杂交瘤细胞高密度培养法。　　二、单克隆抗体的纯化及鉴定　　目前常用的纯化方法有盐析、凝胶过滤、离子交换层析和辛酸提取等方法。　　单克隆抗体性质鉴定方法如放免测定、补体介导溶血试验、ELISA、免疫酶、玫瑰花结形成试验等，最常用的为ELI