乙肝病毒cccDNA检测

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乙型肝炎病毒cccDNA——检测方法与应用价值 一、几个相关问题简介 什么是HBVcccDNA?即共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。 乙型肝炎病毒基因组结构示意图 乙型肝炎病毒的复制过程 我们为什么要关注HBVcccDNA?cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒的复制“池”目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治疗后容易复发的原因之一肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏移植术后乙肝复发的来源还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世 为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?·研究和开发该检测技术的时间不长·检测技术上的难度较大·前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏模，不能满足临床检验的需求·现有技术灵敏度不高，检测低限104copy/ml左右·分研究机构和学者对检测技术的特异性认识不足，存在缺陷 ·多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、rcDNA、ssDNA、整合的HBVDNA），必须有效地分离cccDNA和其他类型的病毒DNA·如何进一步解决特异性的问题？·如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNA含量的较低），血清中含量？·如何简化检测步骤？建立cccDNA检测技术必须克服的难点 cccDNArcDNA核酸一级结构完整的双链两条链均不完整核酸空间结构闭合环状，超螺旋松弛环状，非超螺旋是否与蛋白质结合不结合共价结合对某些核酸酶抗性强，不容易被降解弱，容易被降解分离cccDNA和rcDNA的分子基础分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异 二、HBVcccDNA检测技术 1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介 现有的几种cccDNA检测技术简介选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法 设计一对特殊引物：跨双缺口引物正义引物P1：与负链互补结合，位于正链缺口上游反义引物P2：与正链互补结合，位于负链缺口下游目的：rcDNA不被扩增1.选择性PCR 选择性PCR：rcDNA不被扩增 选择性PCR：cccDNA能被扩增 PCR产物自身退火（selfannealing）“选择性”PCR：并非万无一失 rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠HepatologyResearch2003;15:234-243（PBMC）WorldJGastroenterol2004;10(1):82-85(血清)Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copyHepatology1996;23:405-413血清HBVrcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性“选择性”PCR：并非万无一失 与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA rcDNA不能被扩增无荧光信号EcoRI5‘+P1P23200(1)5‘3‘15903‘1820P118201590+3200（1）EcoRIP2cccDNA能被扩增检测到荧光信号选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 实时荧光定量PCR的原理 实时荧光定量PCR的原理 实时荧光定量PCR的原理 标准曲线方程YCt=42.0827-3.5554logXcopy相关指数：R2=0.995灵敏度至少可以达到103copy/ml结果：选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA ·同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA非特异性扩增的问题·由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普通PCR更高缺陷：选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 质粒标准品107copy/ml3.5×108copy/ml携带者血清质粒标准品105copy/ml105~107copy/ml携带者血清选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 解决方案特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法酶切纯化cccDNA采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safeDNA酶选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA 1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介 2.侵入者探针法(Invaderassay)两个体系：两种特殊的探针：invaderprobe和primaryprobe，后者含与待测模板无关的5’侧翼的碱基片段。荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶Ⅰ(cleavase,裂解酶)特异地切割5’侧翼碱基片段作为第二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团的短臂，发出荧光信号。特点：一个模板可以重复使用，每“结合—裂解—结合—裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大 侵入者探针法定量检测cccDNA的优缺点优点：线性信号放大，特异性比荧光PCR法强缺点：灵敏度低：104copy/ml 1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者分析法（Invaderassaay）嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介 3.嵌合引物荧光PCR法Shao,etal.JVirolMethods2003；112：45-52+PNN：与HBVDNA非同源片段5’N5’3’3’p+rcDNAcccDNA PNNP25’3’5’3’3.嵌合引物荧光PCR法 嵌合引物荧光PCR的优缺点优点：克服了荧光PCR法的部分缺陷，灵敏度比侵入法提高缺点：仍不能完全避免待测标本中存在的rcDNA被非特异性扩增 无论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能解决在高rcDNA背景条件下的假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提高特异性。 三、影响cccDNA池的因素 1.cccDNA池的自身恒定cccDNA池：感染肝细胞核内HBVcccDNA的含量在无外来干扰的情况下保持恒定(5－50copy/cell)病毒自身调节：关于病毒的进化关于病毒的“思维”病毒自身的调节外来压力：打破病毒含量自身恒定的结果 2.抗病毒药物对cccDNA的影响现有抗病毒药物，包括干扰素和各种核苷类似物，可以一过性地减少cccDNA，但均不能清除cccDNA细胞核内cccDNA含量的相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗的必要性 3.肝外组织也是cccDNA的储存池？·肝外组织细胞中HBV标志的存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺等组织或细胞中均检测到HBV的标志物·HBV吸附？暂居？建立感染状态？依据：从上述组织细胞中检测到cccDNA，但必须解决检测技术问题 (2)关于血清中是否存在cccDNA的问题·“血清中rcDNA含量越高，cccDNA阳性率越高和含量越高”的现象，使我们对方法学提出质疑·肝衰竭的病人在一定病期有可能大量释放cccDNA入血·细胞坏死后，cccDNA释放入血是必然的，但是，裸露的核酸分子在血清中存在多少时间？ Thankyou