水稻温敏雄性不育.pptx

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1、内切核酸酶RNaseZS1过表达引起水稻温敏核雄性不育刘永明S20131237四川农业大学生物化学与分子生物学一目的意义二技术路线三材料方法四结果与分析一、目的意义水稻温敏雄性不育：上世纪70年代于我国发现一种水稻的育性转换与日照长短和温度高低有密切关系，即在长日高温条件下，它表现雄性不育;在短日平温条件下，恢复雄性可育，由此这种水稻被命名为光温敏雄性不育系（Thermosensitivegenicmale-sterile，TGMS），该性状受细胞核内一对隐性基因控制。温敏雄性不育系AnS-1在两系制种中应用广泛（~70%），其育性转换温度的起始点为25℃,即环境温度高于25℃时,其花粉表现为

2、不育；而环境温度低于25℃时,表现为可育,并且研究表明温敏不育性受隐性单基因tms5控制，初步定位于第2染色体短臂上。但目前tms5仍未被克隆，其产生核不育的具体机制尚不清楚。本文克隆了安农S-1温敏不育基因tms5，并阐述了其引起核不育的具体机制，证实大部分的温敏不育水稻都是使用tms5作为不育基因。二、技术路线A形态及细胞学观察，确定温敏不育特征B利用F2及NIL群体进行不育基因定位,克隆候选基因tms5(Os02g0214300)C候选基因功能研究：1转基因功能互补验证2利用同源序列并结合原核表达鉴定其具有核酸内切酶功能3GFP与免疫印迹进行亚细胞定位，确定基因作用部位D全基因组微阵列、

3、RNAseq寻找tms5下游靶基因:UBL40I/UBL402/UBL404E鉴定候选基因对目标基因调控机制：原核表达，mRNA原位杂交,UBL40过表达及敲出三、材料方法研究材料：不育基因定位群体：F2(AnS-1×9311);NIL5/NIL8（9311）不育机制研究材料：安农N及其自发温敏不育突变体安农S-1(AnS-1)可育可育可育不育3.1温敏不育形态学观察3.2温敏不育细胞学观察23℃28℃花粉母细胞早期花粉母细胞晚期细线期粗线期二分体小孢子早期3.3不育基因tms5定位及功能研究构建F2(AnS-1×9311);NIL5/NIL8（9311）进行基因定位，发现基因tms5(Os0

4、2g0214300)的CDS区71bp处C→A的碱基颠换引起基因编码提前终止（TCGTAG)。通过免疫印迹发现该基因编码蛋白在AnN中出现，而AnS-1中未出现。转基因验证功能互补：将TMS5即基因Os02g0214300在AnS-1（tms5)中进行表达，发现其花粉育性得到恢复（28℃）。RNAi:通过RNA干扰抑制TMS5的功能，在Zhonghua11与Nipponbare出现了温敏不育的特征。TMS5编码核酸内切酶RNaseZS1通过亚细胞定位和免疫印迹发现RNaseZS1在细胞质中发挥作用，但具体功能未知。3.4tms5下游基因发掘及功能研究通过全基因组微阵列和RNAseq发现tms5

5、植株中三条mRNA序列，它们在22度条件permissivetemperature）下丰度低，而在30度条件(restrictivetemperature)下丰度高。泛素化基因：UbL401(Os09g0452700)UBL40IUbL402(Os03g0259500)UBL402UbL404(Os09g0483400)UBL404UbL40基因受高温诱导并在花粉母细胞特异表达。3.5tms5与UBL40互作研究通过原核表达，发现在含有RNaseZS1编码蛋白中三个UBL40基因产物都降解成小片段，而在不含有RnaseZS1编码蛋白中不发生降解。通过RNA连接酶介导的5’RACE在UBL401

6、中得到多个剪切位点。这些剪切位点在AnN中出现，但AnS-1却没有。3.6UBL40引起水稻温敏不育机制探究通过mRNA原位杂交，检测UBL40表达的时空特异性。构建UBL401和UBL404过表达载体，发现在他们高表达的植株出现类似温敏不育。通过基因敲出UBL401/UBL404，发现他们低表达时植株出现部分育性恢复。四、结果与分析LOWHIGHHIGH揭示了RNaseZS1介导调控UbL40mRNA的一种新机制，证实在水稻中这种调控的丧失导致了TGMS。Idea调控基因功能丧失突变型调控基因功能正常野生型下游差异表达基因非差异表达调控基因A高表达B低表达THANKS