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1、cDNA文库组标准流程一.TotalRNA的提取.2二.mRNA的分离7三．cDNA双链合成.10四．载体制备15五.cDNA双链和载体的连接.18六．电转化流程19七．快速鉴定、菌落PCR.22八．pBlueScriptcDNA库扩增.25资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。一.TotalRNA的提取1.试剂配制准备工作:1、研钵、5ml/10ml/25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部,置于烤箱内,180℃,烤6小时。2、50ml/1
2、.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后,121℃20mins高压灭菌。3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。4、常见试剂及其配方:▲DEPC水:在1000ml去离子水中加入100ulDEPC,静置过夜后高压灭菌。▲0.78M柠檬酸纳:PH=4~5三水合柠檬酸纳22.94g加DEPC水定容至100ml,室温放置备用。▲10%肌氨酸钠:肌氨酸钠10g加DEPC水定容至100ml,室温放置备用。▲变性裂解液:0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC水定容至250m
3、l,室温放置备用临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%(v/v)资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。▲2M醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O13.6g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O20.4g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用▲4MLiCL:LiCL24.164g加DEPC水定容至100ml,高压灭菌,室温放置备用▲0.5MEDTAPH=8.0EDTA18.61g用NaOH调PH值至8.0,定容到100ml,高压灭菌,室温放置备用▲10XM
4、OPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸):MOPS41.86gNaAC·3H2O4.10g0.5MEDTA(PH8.0)20ml用NaOH调PH值6.5,DEPC水定容到1L,室温避光放置备用。▲1xMOPS:10xMOPS30ml加DEPC水270ml,用时现配。▲4xRNALoadingbuffer:10xMOPS400ul资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。甘油(高压过)200UL溴酚兰10ul甲醛(37%)72ul去离子甲酰氨310ulEDTA(0.5MPH8.0)8ulErBr(10mg/mlinDEPCH
5、2O)70ul在4℃可保持3个月▲10xPBSpH=7.4NaCl80gKCl2gNa2HPO414.4gKH2PO42.4g定容至1000ml▲变性电泳胶:称取0.5g琼脂糖,加入47.5ml1xMOPs,加热至琼脂糖熔化后,冷却至50℃左右,加入2.5ml甲醛,轻轻混匀后倒入电泳托上。▲变性电泳缓冲液:在250ml容量瓶内加入5ml甲醛,用1xMOPS定容至250ml2.动物组织totalRNA的提取1．根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量,将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中,冰浴5分钟。2．将组织
6、样品放入变性裂解液中,在高速下匀浆15-30秒/次,直到看不见组织和细胞碎片。3．根据表1加入适量2M的乙酸钠(pH4.0),重复颠倒混匀4-5次。4．根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟。资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。5．冰浴10分钟。6．4C,1g离心20分钟。7．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。8．加入等体积的异丙醇,-20C沉淀30分钟以上。9．4C,1g离心20分钟。10．根据
7、表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。11．加等体积的氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟。12．4C,1g离心20分钟。13．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇,-20C沉淀至少30分钟。14．4C,1g离心20分钟。15．弃上清,加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4C,1g离心10分钟。16．弃上清,空气中干燥RNA沉淀,直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。17．取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置－80
8、C冰箱中保存。表1Mg#oftissue5008001000变性裂解液(ml)58102MNaOACpH4(ml)0.50.81水饱和酚(mL)5810氯仿(mL)11.62异丙醇(mL)468变性裂解液(
