cdna文库组标准流程

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1、cDNA文库组标准流程一.TotalRNA的提取1二.mRNA的分离6三．cDNA双链合成8四．载体制备11五.cDNA双链和载体的连接14六．电转化流程15七．快速鉴定、菌落PCR17八．pBlueScriptcDNA库扩增1918一.TotalRNA的提取1.试剂配制准备工作：1、研钵、5ml/10ml/25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃20mins 高压灭菌。3、电泳槽及电

2、泳托、梳子用3%双氧水处理。4、常用试剂及其配方：▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ulDEPC,静置过夜后高压灭菌。▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三水合柠檬酸纳22.94g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC水定容至250ml，室温放置备用临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O13.6g加DEPC水定容至50ml,高

3、压灭菌，室温放置备用▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O20.4g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲4MLiCL:LiCL24.164g加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用▲0.5MEDTAPH=8.0EDTA18.61g用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用▲10XMOPS(3-（N-吗啉代）丙磺酸):18MOPS41.86gNaAC·3H2O4.10g0.5MEDTA（PH8.0）20ml用NaOH调PH值6.5,DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。▲1xMOPS:10xMOPS30ml加DEPC水2

4、70ml，用时现配。▲4xRNALoadingbuffer:10xMOPS400ul甘油（高压过）200UL溴酚兰10ul甲醛(37%)72ul去离子甲酰氨310ulEDTA(0.5MPH8.0)8ulErBr(10mg/mlinDEPCH2O)70ul在4℃可保持3个月▲10xPBSpH=7.4NaCl80gKCl2gNa2HPO414.4gKH2PO42.4g定容至1000ml▲变性电泳胶：称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml1xMOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。▲变性电泳缓冲液：在250ml容量瓶内加入5ml甲

5、醛，用1xMOPS定容至250ml2.动物组织totalRNA的提取1．根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。2．将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。3．根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。4．根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。5．冰浴10分钟。6．4°C，12000g离心20分钟。7．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了

6、有机相和中间层。8．加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀30分钟以上。181．4°C，12000g离心20分钟。2．根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。3．加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。4．4°C，12000g离心20分钟。5．小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀至少30分钟。6．4°C，12000g离心20分钟。7．弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4°C，12000g离心10分钟。8．弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。9．取

7、少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80°C冰箱中保存。表1Mg#oftissue5008001000变性裂解液(ml)58102MNaOACpH4(ml)0.50.81水饱和酚(mL)5810氯仿(mL)11.62异丙醇(mL)468变性裂解液(mL)0.50.81异丙醇(mL)0.50.8175%乙醇(mL)111DEPC-treatedH20(mL)0.50.813.植物组织totalRNA的提取1.先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。2.将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50