载体构建的基本步骤知识分享.doc

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1、精品好文档，推荐学习交流载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢4精品好文档，推荐学习交流取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。3、酶切（双酶切产生

2、粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒10所需内切酶反应缓冲液2所需限制性内切核酸酶1H2O7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除

3、非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。7、单克隆检测（1）挑单克隆仅供学习与

4、交流，如有侵权请联系网站删除谢谢4精品好文档，推荐学习交流先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。（2）单克隆检测以每管摇好的菌液为模板，以原有的引物进行PCR，然后将PCR产物跑电泳，观察电泳图像中那几管的条带正确，将正确条带相对应管的菌液再抽取100μL，加到3ml（有LB液体培养液，AM

5、P+）试管中，过夜摇；第二天重摇，将摇好的菌取1ml于1.5mlEP管中送测序，并保种。注：①挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。②别忘记往培养基中加AMP。③用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑菌。三、注意事项1．连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实验；2．在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间；3．连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，因此要控制好连接温度。4．进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，导致转化菌中过高的

6、假阳性克隆背景。针对这一问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制DNA片段的自身环化。中国传统文化概论（一） 一、单项选择1.清朝皇帝亲行开耕礼的文物藏品，现保存在北京的()仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢4精品好文档，推荐学习交流A.日B.月坛C.天坛D.地坛2.有历史记载的从事汉字规范的第一人是()A.黄帝B.仓颉C.太史籀D.许慎3.《中国近五千年来气候变化的初步研究》一文的作者是()A.高士奇B.钱学森C.茅以升D.竺可桢4.商朝的鼎盛时期是()A.太甲时期B.武丁时期C.盘庚时

7、期D.祖辛时期5.我国制盐业的迅速发展是在()A.春秋B.战国C.秦代D.汉唐6.表明中国传统社会中央集权管理体制成熟的是()A.宗法制的确立B.分封制的确立C.三公六卿制的确立D.三省六部制的确立7.“天人之分”观点的提出者是()A.荀子B.董仲舒C.刘禹锡D.张载8.在明朝，与著名的西方传教士利玛窦有过来往的思想家是()A.王阳明B.王艮C.李贽D.颜均9.中国科举制度成熟的时期是()A.汉朝B.曹魏C.隋朝D.唐宋10.钟敬文提出“中国民族的传统文化可以分为三种干流”，即上层文化、中层文化、下层文化。又将中下层文化

8、归纳为()A.民俗文化B.市民文化C.娱乐文化D.工艺文化11.在中唐思想界打出“攘斥佛老”大旗的代表人物是()A.韩愈B.柳宗元C.刘禹锡D.白居易12.东汉学者郑玄解释说，“道”是宽多少的路()A.八尺B.十二尺C.十六尺D.二十尺13.在古代，分隔着东方与西方两大文明世界的高原是()A.青藏高原B.云贵高原C.