凝胶过滤法分离蛋白质.docx

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1、实验三凝胶过滤法分离蛋白质【原理】在含有血红蛋白(Mw＝64500)加入过量的高铁氰化钾(K3Fe(CN)6，Mw＝327.25)，血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白(methemoglobin，MetHb)。为了除去多余的高铁氰化钾，得到较纯的MetHb样品，将上述混合物通过交联葡聚糖凝胶柱，用磷酸缓冲液洗脱，从颜色的不同，可直接观察到MetHb(红褐色)洗脱较快，而小分子高铁氰化钾(黄色)洗脱较慢，达到将MetHb完全分离出来的目的。【试剂】1．抗凝全血2．四氯化碳(CCl4)3．生理盐水4．交联葡聚糖G-25(细粒)5．0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)6．0.4%K3F

2、e(CN)6。【操作步骤】1．凝胶准备称取5g交联葡聚糖G-25，倾入锥形瓶中，加蒸馏水约60ml溶胀，搅动后静置。待凝胶沉积后，用倾注法除去浮于表面的细粒，重复3次。将溶胀后的凝胶用10倍体积的磷酸缓冲液浸泡过夜，以达平衡。2．装柱取玻璃层析柱(25cm×1.5cm)一支，垂直装好。加入缓冲液，打开出口，将气泡赶出，关闭出口。然后从管顶向柱内加入缓冲液8cm左右高，将平衡后的交联葡聚糖G-25悬浮液边搅拌边加入柱内，再打开出口，使液体流出，继续不断地加入交联葡聚糖G-25悬浮液，柱内凝胶柱床沉积至高20cm左右时为止。床面上覆盖3ml缓冲液，关闭出口，在凝胶柱面上加盖一层圆形滤纸，使层析

3、柱稳定5～10min后，接储液瓶，打开出口，用2倍于床体积的磷酸缓冲液洗脱平衡，最后关闭出口。3．样品处理(1)血红蛋白溶液的制备取草酸盐抗凝全血3ml离心，吸去上层血浆，加入5倍体积的冷生理盐水，混匀后3000r/min离心5min，弃去上清液，重复洗3次。最后一次吸去上清液后，在红细胞层上面加等体积蒸馏水，振摇。再加1/2体积CCl4，用力振摇3min，3000r/min离心5min。吸取上层澄清的血红蛋白液备用。此溶液中Hb浓度约为10%(置4℃暂存，一周用完)。(2)样品血红蛋白液3滴加K3Fe(CN)68滴和蒸馏水2滴混合，制成MetHb混合样品。4．

4、上样、洗脱打开平衡好的层析柱出口，使柱内溶液流出至刚露出柱床面时即关闭出口。吸混合物样品0.5ml左右，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。然后打开出口，使样品进入床内，直至床面重新露出。同上加入1～2倍样品量体积的洗脱液(这样可以使样品定容至最小，而样品又完全进入床内)，当少量洗脱液将流入床面时，加入多量的洗脱液，但注意切勿搅动床面凝胶，连接储液瓶进行洗脱。5．分部收集用自动部分收集器，以5滴/min，5min/管的速度进行收集。并且观察柱上的色带，待黄色的K3Fe(CN)6色带完全洗脱下来后，再继续收集两管透明的洗脱液作为空白，关闭出口。6．测定将每管收集液

5、加入缓冲液至4ml，混匀，在425nm处测其吸光度，以吸光度为纵坐标，管数为横坐标，绘出洗脱图谱。【注意事项】1．装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。2．流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。