第五章目的基因与载体连接2.ppt

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1、第五章目的基因与载体的连接内容提要基因重组克隆与亚克隆基因重组对载体的要求与载体类型连接前的处理黏性末端连接平端连接人工接头连接同聚寡核苷酸末端连接第一节基因重组克隆与亚克隆外源基因的获取载体的选择与构建外源基因与载体的切割与修饰外源基因与载体的连接（DNA体外重组）重组DNA导入受体细胞重组体的筛选目的基因的表达体外重组就是指目的基因与载体DNA的连接。基因重组是靠DNA连接酶将适当切割的DNA即目的基因与载体共价连接。DNA连接酶能催化相邻或两侧的DNA上裂口核苷酸裸露的3’-羟基和5’-磷酸之间形成共价

2、结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。在分子克隆中中，最有用的连接酶是来自于T4噬菌体的DNA连接酶——T4连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。注意：在连接之前，应结合研究目的基因的特性，来设计最终构建的重组体分子。一、体外连接重组DNA的特点1、DNA体外连接减少了DNA分子进入宿主细胞后遭受降解的危险，增加了转化效率；2、由于限制性内切酶产生的黏端在体外连接，使原来酶的识别序列在整个DNA维持完整性，有利于在重组子转化扩增以后再对外源基因的分离；3、连接时可以控制连接反应条件，有利于形成环状分子或

3、者几个DNA片段头尾相连接的直线多联体。基因重组克隆实质上就是DNA体外重组以及后续的转化过程。亚克隆是指把DNA片段从某一类型载体无性繁殖到另一类型载体的过程。例如：重组λ-噬菌体质粒亚克隆通常是将较大的克隆片段经酶切后，再将所有的小DNA片段与另一个载体连接转化的程序。注意：进行连接反应时，要考虑载体DNA与DNA片段的比率。例如：以自质粒载体形成环状分子，1：1。以λ噬菌体或cos质粒为载体，形成多联体分子，二者的比例相应的就高些。第二节基因重组对载体的要求与载体类型根据重组连接的目的，可将载体分为克隆

4、载体和表达载体。一、克隆载体如果所进行的重组连接暂时不考虑表达量的问题，只是为目的基因的获得或使该基因克隆、亚克隆或扩增、构建DNA文库，可以选择一般的克隆型载体。例如：M13单链噬菌体载体——双链复制型和单链型。双链复制型可作为克隆载体，克隆外源基因后，可以其单链形式作为模板，复制后进行序列分析。基因重组的目的，就是使外源基因能够大量的在宿主中扩增，因此常用的克隆载体是质粒。质粒能高拷贝复制，带有多个单一的酶切位点和抗药性标记。质粒载体中没有强的启动子，因为只能作为克隆载体。二、表达在载体表达性载体能够使目

5、的基因在宿主细胞内进行高效表达，载体具有强启动子和正确的终止子，能高效、高拷贝地转录目的基因，并产生稳定的mRNA和翻译蛋白质。例如：要想获得大量的目的基因的表达产物——表达型载体在为了获得目的基因克隆的基础上，想使目的基因的表达产物容易检测——表达型载体（一）、根据目的基因产生的蛋白质序列，表达载体可分为融合型表达载体和非融合型表达载体。（第十章）（二）、强启动子组建的高表达载体一般有三类：1、含λ噬菌体的PL启动子的质粒：λ噬菌体的PL启动子是一个很强且易于调控的启动子。例如：质粒pPLa2311就是在质

6、粒pBR322中加入PL启动子的质粒载体。2、含lac启动子的质粒：lac启动子是大肠杆菌乳糖操纵子内半乳糖酶基因（lacZ基因）前的一个强启动子。例如：质粒载体Pop203-13和pB-galBC。3、含trp启动子的质粒：trp是大肠杆菌色氨酸操纵子中的强启动子。例如：pNCV质粒载体，曾经成功用于人流感病毒血凝素和口蹄疫病毒VP3抗原的表达。为了进一步提高启动子的强度，使目的记忆高效表达，将上述的lac启动子和trp启动子串联起来，提高了转录速度。例如pTAC12质粒载体。病毒载体大都含有较强的启动子，

7、能保证插入的外源基因有效转录和表达，且转染的效率要高于转化，因而也长作为目的基因的表达载体。第三节连接前的处理为了提高连接效率，需要在连接前将载体DNA和目的基因分别进行处理。一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子。载体DNA通常有许多酶切位点，但并不是所有的酶切位点可用于重组切割。一、理想的酶切位点应符合下列几个条件1、位于载体上特定的酶切位点要尽可能的少，最好是单一酶切位点，这样才能保证目的基因和载体DNA以最该的概率正确组合；例如：pBR322上的BamⅠ（tetr）和PstⅠ

8、（ampr），通过插入失活和“影印法”筛选重组体。2、在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达。例如：高效表达质粒pMH621的galⅡ位点前有一个OMP多肽基因启动子OMPF，外源基因插入后可表达出外源基因与OMP多肽融合的蛋白。OMP多肽是细菌外膜蛋白的主要成分，因而可使外源基因在细菌外抹上表达，有利于产物的收获和提取。3、选择的载体必须在连接重组后对基因