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时间:2017-11-12
《t载体与目的基因连接》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、一.重组质粒的构建T质粒载体 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。 DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA
2、连接酶催化DNA连接反应分为3步:首先,T4DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。 很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的载体,载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样,pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对,在连接酶的催化下,就可以把PCR产物连
3、接到pUCm-T载体中,形成含有目的片断的重组载体。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。二.感受态制备原理 细菌在0°CCaCl2低渗溶液中胀成球形,丢失部分膜蛋白,成为容易吸收外源DNA的感受态。三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法 LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因,可以编码β—半乳糖核苷酶。β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体,可催化乳糖
4、的水解.用X-Gal为底物进行染色时,呈蓝色。 现在一些特定的质粒(比如pUC/pBS等),常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸(α肽段)的编码序列,在这个编码序列里还插入一个多克隆位点(MCS),它并不影响lacZ的表达。另外,常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列(β肽段),的编码序列。在各自独立的情况下,这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞,在培养基诱导物IPTG的诱导下,载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端(α肽
5、段),这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列(β肽段)互补,形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。 而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后,会造成lacZ基因不能表达,从而不能合成β—半乳糖核苷酶;而对于空载体,lacZ基因正常表达,通过α互补合成β—半乳糖核苷酶,分解培养基里的色素底物X-gal,最终形成蓝色的化合物,出现蓝色菌斑。实验准备:清洗,5个100ml锥形瓶(外加1个小的),6副培养皿,3个小试剂瓶,接种环,涂布棒。准备100ml超纯水。溶液:LB300ml(液体50ml+50ml,固体100ml)
6、,0.1mol/LCaCl210ml,100mg/mlAmp1ml,20mg/mlX-gal1ml,200mg/mlIPTG1ml。大肠杆菌菌液1ml。感受态细胞连接产物4管4x5=20ul做4份目的基因T载体T4连接酶10x冲液4x4uL4x1uL4x0.5uL4x1uL 灭菌:5个100ml锥形瓶(外加1个小的),6副培养皿,3个小试剂瓶,接种环,涂布棒,10ml超纯水,LB培养基,1.5mlEP管,大小枪头,过滤用具2副,,0.1mol/LCaCl2实际配置 20mg/mlX-galX-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半
7、乳糖苷。用二基甲酰胺(DMF)溶解X-gal配制成的20mg/ml(取0.02gX-gal,用DMF定容为1ml)的贮存液。保存于一玻璃管或聚丙烯管中,装有X-gal溶液的试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏,并应贮存于-20℃。X-gal溶液无须过滤除菌。(DMF二甲基甲酰胺;Dimethylformamide;N,N-Dimethylformamide;DMF;CAS:68-12-2 理化性质:无色、淡的胺味的液体。分子式C3-H7-N-O。分子量73.10。相对密度0.9445(25℃)。熔点-61℃。沸点152.8℃。)溶于DM
8、SO,溶解度可达20mg/ml。也溶于DMF溶于DMSO,溶解度可达20mg/ml。也溶于DMF 200mg/mlIPTG在0.8ml蒸馏水中溶解0.2gIPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤
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