细胞培养操作流程.doc

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1、细胞培养操作流程细胞复苏胎牛血清提前一天放至4℃冰箱解冻↓开水浴箱至37℃，CO2培养箱调温度至37℃，CO2浓度为5%↓分装DMEM培养液，配制培养液：DMEM9mL加胎牛血清1mL，并将7mL加入培养瓶中，并编号↓液氮中取出保存的小鼠肺成纤维细胞冻存管，立即放入37°C水浴箱中轻轻摇晃，争取1min后融化（避免水浴箱水位高于冻存管管口）↓75%酒精擦拭消毒冻存管，吸出细胞悬液加入15mL离心管中，1000转/分离心5min↓弃上清，加入3mL培养液，吹打分散细胞↓将细胞吸至培养瓶，镜检，瓶口旋松1/4行程后放入培养箱培养细胞换液（可用于传代、转染及冻存前1天予换

2、液1次）DMEM培养液（含5%胎牛血清）平衡至室温↓细胞面向上，轻轻倒掉培养液↓加入8mL5%胎牛血清DMEM培养液，瓶口旋松1/4行程后放入培养箱培养细胞传代预热PBS至37℃，0.25%胰酶、DMEM培养液（含5%胎牛血清）平衡至室温↓细胞面向上，轻轻倒掉培养液。PBS液洗2次↓加入500µL0.25%胰酶消化酶30S，加入2mL5%胎牛血清DMEM培养液，吹打↓吸出细胞悬液加入15mL离心管中，1000转/分离心5min，弃上清，加入2mL5%胎牛血清DMEM培养液，吹打↓分装至4个培养瓶，加入5mL5%胎牛血清DMEM培养液↓编号、镜检，瓶口旋松1/4行程后

3、放入培养箱培养↓传代细胞密度不应低于5x105/ml细胞冻存配制冻存液（7mLDMEM+2mL胎牛血清+1mLDMSO）预热PBS至37℃，0.25%胰酶平衡至室温↓细胞面向上，轻轻倒掉培养液。PBS液洗2次↓加入500µL0.25%胰酶消化酶30S，加入2mL5%胎牛血清DMEM培养液，吹打↓吸出细胞悬液加入15mL离心管中，1000转/分离心5min，弃上清，加入1ml冻存液，吹打↓混匀分装入冻存管，用胶布封闭管口致于有棉花的盒子中包裹↓-20°C降温2小时、-80°C冰箱过夜↓转入液氮中冻存细胞转染常规传代细胞至六孔板，过夜↓转染体系：1µg质粒加100µLD

4、MEM培养液（无血清及双抗），5µL脂质体加100µLDMEM培养液，室温放置5min后混合，静置15min↓抽出原液，加入2mLDMEM培养液，清洗2次↓加入转染体系，可覆盖底部即可↓4h后将培养液换为2mL5%胎牛血清DMEM培养液，继续培养观察，48h荧光最强