J-05天然生物材料的提取制药第三节多肽和蛋白质类药物的生产.doc

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1、第五讲授课内容第二章天然生物材料的提取制药第三节多肽与蛋白质类药物的生产2授课时数2教学目标掌握多肽类药物胸腺素和蛋白质类药物胰岛素的特性和提取生产方法。教学重点胸腺素的提取生产工艺教学难点胸腺素和胰岛素的特性教材教具教学内容（含教学步骤、时间分配、教法学法、作业布置等）复习多肽药物种类，多肽类药物降钙素和胸腺激素的功能、结构和生产工艺。导入新课：胸腺素、胰岛素分别是多肽和蛋白质类药物的代表，它们在临床上都有重要的作用。比如胸腺素具有诱导T细胞分化，维持机体的免疫平衡状态；胰岛素能调节血糖浓度，治疗胰岛素依赖性糖尿病。第三节多肽与蛋白质类药物的生产五、典型多肽和蛋白质类药物

2、的生产实例（一）提取法生产胸腺素1966年Goldstein等首次报道从小牛胸腺中提取了部分纯化的胸腺素，1972年进一步纯化分离得到一组具有免疫活性的多肽，称胸腺素F5（即从小牛胸腺提取得到的第5种组分），并可提供临床使用。1、结构与性质胸腺素是几十种多肽组成的混合物，相对分子量在1万以下；等电点在3.5～9.5；为了便于不同实验室对这些多肽的鉴别和比较，根据它们的等电点以及在等电聚焦分离时的顺序而命名，共分三个区域：α区：3.5～5.0三个区域β区：5.0～7.0γ区：7.0～9.5胸腺素对热稳定，短时间内加热至80℃，其生物活性不降低。2、生产工艺路线小牛胸腺[预处理

3、]胸腺碎块[提取]提取液去脂肪和结缔组织，绞碎0.9%NaCl-0.5%辛醇[过滤]上清液(F1)[除杂蛋白]上清液(F2)[盐析]上清液(F3)纱布过滤80℃，冷却25%硫酸铵[盐析]沉淀(F4)[除杂]上清液[色谱分离]洗脱液25%硫酸铵溶解，离心SephadexG-150柱[脱盐]洗脱液[干燥]胸腺肽（F5）SephadexG-25柱冷冻干燥3、工艺过程a．预处理：去脂肪，绞碎b．提取：生理盐水（盐水溶液），匀浆，离心（组分1）c．除杂蛋白：加热，60℃，离心（组分2）d．纯化：分段盐析pH=7.0磷酸盐缓冲液，硫酸铵饱和度0.25，上清液（组分3）调pH=4.0，硫

4、酸铵饱和度0.5，盐析物（组分4）除杂0.1Mtris-HCl缓冲液（pH=8.4）溶解，4000×离心30min色谱分离凝胶层析SephadexG-150柱，第3个峰（葡聚糖凝胶，分离范围5,000～300,000）脱盐凝胶层析SephadexG-25柱，第1个峰（分离范围1000～5000）e．干燥：冷冻干燥（组分5）4、工艺讨论（1）除加热步骤外，所有步骤应在0～4℃下进行。（2）组分4过SephadexG-150柱时，在276nm波长检测共有4个吸收峰，胸腺素活性位于第3个峰。进一步SephadexG-25柱脱盐，共有2个吸收峰，胸腺素活性位于第1个峰。5、药理作用

5、与临床作用促进T淋巴细胞分化成熟。（1）临床上主要用于治疗细胞免疫缺陷疾病，如胸腺发育不良、重症联合性免疫缺陷症、多次感染综合症等；（2）肿瘤化疗和放疗并用胸腺素可使细胞免疫应答增强，从而加强化疗和放疗的抗肿瘤效果。（3）用于治疗急性红斑狼疮。（二）提取法生产胰岛素1、功能和来源（1）功能调节血糖浓度，治疗胰岛素依赖性糖尿病。1965年，我国完成了世界上第一个人工合成蛋白质——牛结晶胰岛素的全合成工作。（2）来源胰脏中胰岛β细胞（α细胞、β细胞、γ细胞）分泌的一种蛋白质激素。2、结构与性质（1）结构由A链、B链通过2个二硫键连接而成。（2）性质①白色或类白色结晶粉末②相对分

6、子量：牛5733，猪5764，人5784③胰岛素在pH=4.5～6.5范围内几乎不溶于水④在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定3、生产工艺路线冻胰[提取]胰片[提取]提取液[碱化]碱化液[酸化]刨碎乙酸,草酸氨水pH8～8.4硫酸pH3.6～3.8酸化液[浓缩]浓缩液[去脂]去脂溶液[盐析]盐析物减压蒸发速热速冷NaCl,pH2～2.5盐析物[酸化]滤液[锌沉淀]沉淀水、丙酮,氨水pH4.2～4.3氨水,乙酸锌,pH6[碱化][结晶]结晶[洗涤][干燥]胰岛素精品柠檬酸、乙酸锌、丙酮，氨水,pH8,过滤调pH6水,丙酮、乙醚真空干燥4、工艺过程方法：酸醇法和锌沉淀法（

7、1）提取：酸醇法（2）碱化、酸化：除碱性蛋白、酸性蛋白（3）浓缩：30℃以下，减压浓缩（4）去脂、盐析（5）酸化、锌沉淀：除酸性蛋白（6）碱化、锌沉淀：除碱性蛋白（7）洗涤、干燥六、多肽和蛋白质含量测定（一）多肽、蛋白质含量测定1、凯氏定氮法2、紫外分光光度法3、福林-酚试剂法（二）纯度的检定1、电泳均一性测定2、高速离心法3、可结晶性4、蛋白质功能及免疫抗原性测定小结：本次课须掌握多肽类药物胸腺素和蛋白质类药物胰岛素的特性和提取生产方法。思考题：1、简述水解提取法生产胸腺素和胰岛素的生产工艺路线？课后体会：