RNA提取和反转录.doc

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1、RNA提取实验方法1、准备工作：a、按照2.1.3.2收样方法，收取PH-1野生型分生孢子、菌丝（6h、12h、24h、36h）、9d子囊壳。b、200℃高温对研钵和研磨棒灭菌。c、电泳槽用3%的H2O2浸泡过夜后用去离子水洗净待用。d、用70%酒精将超净工作台和研磨样品所需的桌面擦洗干净。2、将样品倒入液氮预冷的研钵中，迅速研磨（3次），待将要液氮挥发完全时，将样品粉末倒入RNA专用离心管内。加入1mlTrizol，涡旋震荡至混合均匀。3、静置10min后，加入200μL氯仿上下翻转至混合均匀。4、4℃，1000rpm离心15min5、将上部澄

2、清液转移到新的无菌的1.5ml离心管中，然后加入等体积与管内溶液的异戊醇。6、静置15min后，4℃离心机10000rpm，15min。7、倒去上清，加入1ml的75%乙醇。洗涤沉淀。8、7500rpm，4℃，离心5min，倒去上部澄清液，置于超净台中吹干。9、加入100-200μL的DEPC水溶解沉淀。10、溶解后取5μL稀释10倍测RNA浓度。11、电泳检测。DNA的消解1、在1.5ml离心管中配制以下反应体系：TotalRNA20μg10×DNaseIreactingbuffer10μLDNase（RQDNAse-free，DNase）30

3、μLRNAfreewater至100μL2、37℃水浴30min。3、分别加入400μLDEPC水和500μL的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），混匀后4℃，1000rpm离心10min。4、将上部澄清液体转移至新的无菌的1.5ml离心管中，加入等体积于管内溶液的氯仿。上下翻转后4℃，1000rpm，10min。5、将上部澄清液体转移至新的1.5ml的离心管中，加入2倍体积于管内溶液的100%乙醇后，置于-20℃冰箱过夜沉淀。6、4℃，12000rpm，离心15min。7、倒去上清，75%乙醇洗涤沉淀。8、4℃，12000rpm，离心15min

4、。9、倒去上清，100%乙醇洗涤沉淀。10、倒去上清，吹干后，加30μLDEPC水溶解。11、溶解后，取出2μL测OD。反转录PCR管中加入：模板RNA1μgPrimer：digo（dT）18primer1μLDEPC水至12μL混匀后，微离心，置于65℃，5min。将PCR管插于冰上冷却10min，加入：5×reactionbuffer4μL(20μ/μl)RibdockTMRNaseinhibitor1μL10mMdNTPmix2μL（200μ/μl）ReverseTranscriptase1μL混匀后，微离心，置于42℃，1h。70℃，5m

5、in终止反应。-20℃保存。RNA提取和后处理Isolation准备工作TRIZOL,Chloroform,Isopropylalcohol,75%Ethanol(inDEPC-treatedwater),DEPC-treatedwater2mltube(RNasefree),1.5mltube(RNasefree),PCRtube(RNasefree),cuttips(RNasefree)步骤HOMOGENIZATIONSLysestissues(around0.1g)inliquidnitrogenandtransferitinto2mltu

6、beAdd1mlTRIZOLassoonasnitrogenvaporizesShaketubesvigorouslytomixwellIncubatethehomogenizedsamplesatRTfor5minPHASESEPARATIONAdd0.2mlofchloroformper1mlofTRIZOLReagent.Capsampletubessecurely,shaketubesvigorouslyfor15sIncubatethemfor2~3minat4℃Centrifugethesamplesatnomorethan12,00

7、0gfor15minat4℃Transfertheaqueousphase(upperphase)toafreshtubeRNAPRECIPITATIONPrecipitatetheRNAfromaqueousphasebymixingwith0.5mlofisopropylalcohol.Incubatesamplesfor10minat4℃Centrifugeatnomorethan12,000gfor10minat4℃RemovethesupernatantRNAWASHWashtheRNApelletoncewith1mlof75%eth

8、anol.Mixthesamplebyvortexingandcentrifugeatnomorethan7,500gfor5minat