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时间:2020-08-17
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1、植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。在酸性条件下,脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的有色产物,该产物在520nm有一最大吸收峰,其色度与含量正相关,可用分光光度法测定。该反应具有较强的专一性,酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成有色产物,碱性氨基酸对这一反应有干扰,但加入人造沸石(permutit),在PH1~7范围内振荡溶液可除去这些干扰的氨基酸(如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸,精氨酸等2—氨基的氨基酸)。3.酸性茚三酮试剂:称取2.5g茚三酮,加入60mL冰醋酸和40mL6mol/L磷酸,于70℃加热溶解,冷却后
2、储于棕色试剂瓶中,4℃保存,两天内稳定。4.脯氨酸标准母液:称取10mg脯氨酸溶于少量80%乙醇中,再用蒸馏水定容至100mL,成100μg/L母液。测脯氨酸含量:1.脯氨酸标准曲线制作:吸取脯氨酸标准母液0,0.5,1.25,2.5,5.0,7.5,10.0,15.0mL分别放入8个50mL容量瓶中,分别加入蒸馏水定容至50mL,配成0.0,1.0,2.5,5.0,10.0,15.0,20.0,30.0μg/mL的系列溶液。分别吸取上述各标准溶液2mL,冰醋酸2mL,茚三酮试剂2mL,加入到10mL带塞刻度试管中,塞上塞子,
3、于沸水浴中加热15分钟,用分光光度计测定520nm的光密度值,以零浓度为空白对照。将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标制作标准曲线。2.测定样品的脯氨酸含量(1)提取脯氨酸:分别称取胚轴,每种处理各取三份,每份0.3g。剪碎,加入适量80%乙醇,少量石英砂,于研钵中研磨成匀浆。匀浆液全部转移至25mL刻度试管中,用80%乙醇洗研钵,将洗液移入相应的刻度试管中,最后用80%乙醇定容至刻度,混匀,80℃水浴中提取20分钟。(2)除去干扰的氨基酸:向提取液中加入约0.4g的人造沸石和0.2g活性碳,强烈振荡5分钟,过滤
4、,滤液备用。(3)脯氨酸含量的测定:分别吸取上述提取液2mL于刻度试管中,再取一支刻度试管,加入2mL80%乙醇作为参比,分别向上述各试管中加入2mL冰醋酸和2mL茚三酮试剂,沸水浴中加热15分钟,冷却后在分光光度计测520nm处各样品的光密度,从标准曲线上查出每毫升被测样品液中脯氨酸的含量。样品中脯氨酸含量的计算:脯氨酸含量(μg/g)=(cxv/a)/w或脯氨酸含量(%)=[(c*v)/a]/w*106×100其中,C:由标准曲线上查得的脯氨酸微克数;v:提取液总体积(mL)a:测定液体积(mL)w:样品重(g)
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