Western blot 转膜及膜的选择.pdf

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1、Westernblot转膜及膜的选择转膜：经过PAGE电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从PAGE胶转移到膜上固定，才能用各种方法进行WesternBlot的检测和显色，而且为了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散，转移要尽快进行转膜的首要是选膜。在转移膜上显色其实就像是画家在画布上作画一样，不光要有好的画笔和颜料，适合的画布也是相当之重要。WesternBlotting亦是如此，没有选择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。因此，选择适合的转移膜，要让转移“膜”高一尺，帮衬而不是阻碍到我们的实验。WesternBlot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocel

2、luloseBlottingMembranes，NC）和PVDF膜（Polyvinylidene-Fluoride），此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。具体哪种膜适合于哪些实验呢？选择的根据主要有：a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜，就像国画要选择宣纸，油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。转膜是对westernblot最终结果影响最大的一步，转膜质量的好

3、坏直接决定了实验结果的好坏。转膜的影响因素不多，主要有膜的选择、转印方法和实验操作三个方面。首先是膜的选择问题。膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。例如，要做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的NC膜是不可取的，因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定，从而影响到最终结果的可靠性。而如果所分离的蛋白需要进行测序，则非PVDF膜不可，因为只有PVDF膜才能经受住严酷的清洗条件。常用的westernblot用膜有NC膜、PVDF膜和尼龙膜，它们的一些主要的特点总结如下表：NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分辨高高高率背景低较高低125－200ug/cm2（适合于S

4、DS结合能力80－110ug/cm2>400ug/cm2存在下与蛋白质的结合）材料质地干的NC膜易脆软而结实机械强度高溶剂耐受性无无有操作程序缓冲液润湿,避免气泡缓冲液润湿使用前100%甲醇润湿常规染色，比较于NC膜，可常规染色，可用放射性和非不能用阴离子检测方式用考马斯亮蓝染色，可用于ECL放射性检测染料检测，快速免疫检测。0.45um一般蛋白低浓度小分子0.2um一分子量小于20kD蛋白、酸性蛋适用范围蛋白白、糖蛋白和蛋糖蛋白检测和蛋白质测序0.1um一分子量小于7kD蛋白多糖(主要用白在核酸检测中)价格价格较便宜便宜较贵其次是转膜方法的选择。主要有半干法转膜和湿法转膜。半干法操作要求

5、高，但效率也高。湿法操作要求相对低，花时间多一些。最后是实验操作方面的问题。使用PVDF膜的时候需要进行预处理，这里面会带来一些问题，如甲醇润湿不够，膜的有些区域不能很好的结合蛋白就会引入误差。膜上面一定不要有油脂类的东西，否则也会影响蛋白结合和抗体的杂交。1.硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，对蛋白有很强的结合能力，而且适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很简便，比如不需要甲醛预处理，只要在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可以了；比如NC膜很容易封闭，也不需要

6、特别严谨的清洗条件。转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，Schleicher&Schull公司的一个实验表明，转移到NC膜上的几种蛋白4度条件下保存5年依然保持免疫识别特性，依然可以得到清晰可信的WesternBlot结果。不过要注意的是纯的硝纤膜在比较脆，又容易卷，操作要小心，不适合用于需要多次重复清洗的用途——因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。另外还要注意选择纯的NC膜——混有含醋酸纤维（CM）的NC膜结合力

7、会有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上结合的蛋白会因为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）。硝纤膜最为大家熟悉和认可的品牌就是Schleicher&Schull；Millipore；PALL，另外罗氏、Invitrogen、GE（Amersham）、SantaCruz等公司都有提供各式的硝纤膜（估计OEM的可能性比较大，不过有时挺奇怪的，OEM