CFX96 实时荧光定量PCR培训教材PPT.ppt

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1、实时荧光定量PCR原理与应用GeneExpressionDivisionChinaMarketingBio-RadLaboratories提纲PCR定量PCR荧光化学监测物质实时荧光定量PCR应用PCR目的及背景多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝.分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，

2、ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反应过程见图。传统PCR传统PCR传统PCR通过凝胶电泳对终产物进行定性分析(30cycles)传统PCRRealityTheoreticalincreaseLogTargetDNACycle#Intheory,PCRreactionsamplifyexponentially,doublingeverycycleandgrowforever.Inreality,PCR:理论vs.实际100倍稀释普通PCR分析终产物特点10810610

3、2104提纲PCR定量PCR荧光化学监测物质实时荧光定量PCR应用定量PCR通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析5’模板Cycle15’2X模板4X模板30-40循环Cycle25’5’5’5’荧光检测FFFFFFFF荧光监测化学物质LogViewLinearView本底期、指数扩增期、平台期荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时（进入指数增长期）所经过的扩增循环次数ThresholdlineC(t)valueC(t)value18.12+/-0.04ThresholdlineC(

4、t)valueC(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04C(t)value18.12+/-0.04荧光阈值与Ct值定量PCR分析初始模板特点108标准曲线106108标准曲线104108106标准曲线108106102104标准曲线108106102104T标准曲线标准曲线108106102104T标准曲线105copies/well标准曲线Ct值特性ProductT=(Template0)2n(n=#ofcycles)120ng60ng30ng15ng24.38±0.0925.64±0.0926.68±0.0427.71±0.04InputC(t)P

5、roductT=(Template0)23.32=(Template0)101X1061X1051X1041X1031X10217.09±0.0420.10±0.0623.41±0.0526.68±0.0530.26±0.26InputC(t)定量PCR优点定量：对初始模板的绝对定量优点：更灵敏，宽广的动力学范围污染机会少：闭管化学没有后处理：不用杂交、电泳、拍照操作简单：高度自动化用途广泛：既能定量又能定性灵活：既可多点测定，又可单点测定提纲PCR定量PCR荧光化学监测物质实时荧光定量PCR应用非特异性标记SYBRGreenIEvaGreen荧光化学物质特异性的荧光探针TaqMan分子信标(

6、Molecularbeacons)SYBRGreenISYBRGreenISYBRGreenISYBRGreenISYBRGreenI使用方便，只需要一对引物－－不必设计复杂的荧光探针熔解曲线－－鉴定PCR有无杂带、引物二聚体便宜灵敏无模板特异性－－不能分辨非特异产物不能做复合PCR扩增融解曲线反应程序1、融解曲线在定量PCR反应完成之后2、软件自动分析结果，生成融解曲线图谱融解曲线分析-原始图谱融解曲线分析-导数图谱EvaGreen饱和荧光染料非饱和双链DNA荧光染料：e.g.SYBRGreenI饱和双链DNA荧光染料：e.g.EvaGreenSaturationDyesDyesaturat

7、ionleavesnoroomforrelocationeventsduringmelting饱和染料特点饱和型的专用DNA染料高浓度不抑制PCR反应当双链DNA局部解链时，游离下来的染料不会重新结合到DNA分子上去,荧光强度的降低精准可靠地反映出DNA分子的解链情况EvaGreenMixBio-RadPCR抑制作用Source:Barrettetal.,QuantaceLtd.1x1.5x染料重