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1、荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光3650入或紫蓝光4200入)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。这样在强烈的对衬背景下，即使荧光很微弱也易辨认，敏感性高。主要用于细胞结构和功能、细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位以及化学成分等的研究。荧光显微镜就其光路来分有两种： 1．透射式荧光显微镜：激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大倍数增加
2、其荧光减弱．2．落射式荧光显微镜：这是近代发展起来的新式荧光显微镜，与上不同处是激发光从物镜向下落射到标本表面，即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。光路中需加上一个双色束分离器，它与光铀呈45度角，激发光被反射到物镜中，并聚集在样品上，样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜，反回到双色束分离器，使激发光和荧光分开，残余激发光再被阻断滤片吸收。此种荧光显微镜的优点是视野照明均匀，成像清晰，放大倍数愈大荧光愈强。荧光显微镜的使用方法1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮
3、点。 2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。 3．用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。 4．放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：未装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。 5．观察。荧光显微
4、镜在各领域的应用细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。荧光显微镜在各领域中的应用都非常广泛。(1)荧光显微镜的应用包括一般荧光染色和免疫荧光染色方法,荧光染色方法可以显示细胞内的各种成份,特别是对细胞内的两种核酸(DNA或RNA)及酸性粘多糖有较强的特异性,所以荧光染色法可以作为一种良好的细胞化学方法。免疫荧光方法是把免疫学技术和荧光染色结合起来一种方法,它具有
5、免疫学的特异性和荧光方法的敏感性,作为一种研究方法或实验手段,广泛地应用于医学领域内各种基础理论研究和临床诊断,如组织细胞学,微生物学,寄生虫学,病理学的研究以及自身免疫病诊断。20世纪30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究。如用抗酸菌荧光染色法可帮助人们在痰中找到结核杆菌。40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术,这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中,可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体,可用以探讨病因及发病机理,如肾小球疾病的分类及诊
6、断,乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等。(2)荧光显微镜在植物研究中的应用也非常广泛。利用某些物质在短光波照射下即可发生荧光的特性,对植物细胞用荧光显微镜进行观察研究。如细胞内大部分脂质和蛋白质经照射均可发出淡蓝色荧光,而叶绿体发出火红色荧光。但大部分物质仍需要用荧光染料(如吖啶橙、异硫氰酸荧光素等)染色后,在短光波照射下才能发出荧光。采用荧光显微镜技术,可以观察桔梗花粉管自花授粉、自株花授粉、异花授粉下花粉粒的萌发生长,以及柱头内外授粉花粉粒的萌发情况。现在在植物细胞凋亡机理的研究中对线粒体进行染色后,用荧光显微镜能够
7、很清晰地观察到活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。利用荧光标记技术显示微管,可以在多种植物生殖细胞内清楚地看到微管骨架的存在。在植物细胞的观察研究中,通过染色可以更清晰地观测到细胞的形态及结构。在实验中发现,荧光显微镜还可以直接(不做任何处理)观察植物叶的气孔器,而且能观察到气孔的变化情况,为荧光显微镜找到了一种新用途。左图是哥伦比亚大学的简·施莫兰泽(JanSch-moranzer)，在经过血清饥饿处理的成纤维细胞的受创细胞膜上，拍摄到的微
8、管结构图(绿色)。从图上看来，成纤维细胞的微管已经表现出异常行为。微管的直径约20nm，通常情况下，当细胞膜上有裂口时，微管会向裂口处聚集，但图中反映的情况却不是这样。在细胞分裂间期，杜克大学的U·塞尔达尔·图卢(U.SerdarTulu)在138μm宽的视野中，拍摄到了染色体(蓝色)周围正在形成的微管(黄色，右图)。(2)荧光显微镜在动物研究方面的研究也非
