讨论二：RNA检测课件.ppt

《讨论二：RNA检测课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、RNA药学1201班1组基本内容1、人类细胞质RNA的提取2、RT-PCR技术3、RNA的琼脂糖凝胶电泳基本内容1、人类细胞质RNA的提取2、RT-PCR技术3、RNA的琼脂糖凝胶电泳RNARNA概论常见提取方法技术应用DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA是遗传信息的主要载体，蛋白质是生命的物质基础，在DNA和蛋白质之间,RNA起着中介作用。与DNA相比,RNA种类较多,分子量相对较小,在遗传信息表达和调控过程中各类RNA分别发挥作用。这是我们对RNA的基本知

2、识。下面图示为中心法则：1、人类细胞质RNA的提取RNA概论rRNA基因组RNAmRNA样非编码RNA小胞质RNA小核RNA核仁小RNA端粒酶RNA反义RNAtmRNAGuideRNA核酶RNAtRNAmRNARNA信使RNA(mRNA)携带从DNA转录来的遗传信息转运RNA(tRNA)负责蛋白质合成时氨基酸的转运核糖体RNA(rRNA)在核糖体中起装配和催化作用具有催化作用的RNA即核酶RNA和其它RNA的自我催化分子基因组RNA指一些病毒以RNA为遗传物质指导RNAmRNA样非编码RNA其转录

3、和加工方式同mRNA,但不翻译为蛋白质tmRNA本身既是mRNA又是tRNA,翻译时一身二任，如大肠杆菌中的10SaRNA小胞质RNA存在于细胞质中的小RNA分子，如信号识别颗粒小核RNA是剪接体的组分是指导RNA编辑的小RNA分子核仁小RNA参与rRNA的加工端粒酶RNA是真核生物端粒的模板反义RNA可通过与靶位序列互补而与之结合的RNA,或直接阻止靶位序列功能，或改变靶部位构象而影响其功能。1、人类细胞质RNA的提取常见提取方法异硫氰酸胍一步法提取RNA异硫氰酸胍氯化铯超速离心法盐酸胍－有机溶

4、剂法氯化锂－尿素法1）异硫氰酸胍一步法提取RNA主要原理异硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚/氯仿抽提，使RNA与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。1）异硫氰酸胍一步法提取RNA操作流程1.100mg组织加1ml变性液冰浴匀浆。2. 将匀浆液移人5ml Eppendorf管内，加 0.1ml 2mol/L乙酸钠 pH4.0，颠倒混匀，加 1ml水饱和酚，彻底混匀，加 0.2ml 49:1 氯仿／异

5、戊醇，彻底混匀，0－4℃培育 15min。3. 于4℃以 10000r／min离心 20min，移上清水相到另一管。4.加lml100％异戊醇沉淀RNA－20℃30min，于4℃以10000r／min离心10min，弃上清液。5.溶解RNA沉淀在0.3ml变性液中，移入1.5ml离心管中。6.用0.3ml100％异丙醇沉淀RNA－20℃30min，10000r／min离心10min弃上清液。7. 悬RNA在75％乙醇中，振荡，室温孵育10－15min。8. 10000r／min弃上清液

6、，真空干燥5－10min。9. 用DEPC水100－200ul溶解RNA样品，可存于－70℃或在乙醇中置－20℃保存。1）异硫氰酸胍一步法提取RNA注意事项1 .操作时必须戴手套。2. 所用的器皿和试剂均须经 DEPC水处理或 250－300℃干烤4h。3. DEPC致癌。2）异硫氰酸胍氯化铯超速离心法主要原理异硫氰酸胍抑制RNA酶的活性，以CSCl为介质，进行密度梯度离心，分离RNA时，因RNA在CSCl溶液中的密度比蛋白质和DNA大，经离心后，RNA沉降到管底而DNA与蛋白质溶于上清液中

7、，达到分离RNA的目的。2）异硫氰酸胍氯化铯超速离心法操作流程1.加5－7倍于组织细胞体积的异硫氰酸肌匀浆液至含样品的勾浆器中。高速匀浆l－2min。2.加十二烷基肌酸钠（SLS）至终浓度0.5％，混匀，5000r／min室温离心10min。3.在Beckman离心机相应离心管中，20℃按下表超速离心。4 .弃2／3 GIT溶液，用吸管将下1／3吸出，用于染色体DNA的制备，管底胶状沉淀即总RNA。5 .用70％乙醇洗RNA沉淀，弃乙醇，干燥。6. 用300ul TE pH7.6（含0.1

8、％SDS）溶解 RNA沉淀，用等容积酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。7.上清加人0.1体积3mol/LNaAc（PH5.2），2倍体积乙醇混匀，－70℃30min。8.于4℃以12000r／min离心10min，弃上清液，70％乙醇漂洗RNA沉淀，12000r/min离心5min，弃上清液，真空抽干燥。9.DEPC水适量溶解RNA，测定OD260与OD280，计算RNA的质量与浓度，－20℃或加3倍体积的乙醇－70℃保存。2）异硫氰酸胍氯化铯超速离心法注意事项1 .本方法适用于