HPLC高效液相色谱课件.ppt

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1、高效液相色谱法HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：第一节概述1．高效液相色谱法与经典液相色谱法HPLC优点：高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百

2、倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达10cm3·min-1.如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用HPLC，只需lh之内即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.第一节概述2．HPLC与GC(1)GC分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近8

3、0％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用HPLC进行分离和分析。(2)GC采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而HPLC中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。第一节概述(3)GC一般都在较高温度下进行的，而HPLC法则经常可在室温条件下工作。总之，HPLC是吸取了GC与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前HPLC已被广泛应用

4、于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。HPLC主要缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。第一节概述3.液相色谱分离原理及分类和GC一样，LC分离系统也由固定相和流动相组成。其固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作

5、用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。第一节概述第二节高效液相色谱仪器第二节高效液相色谱仪器一、流程（processofHPLC）首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。第二节高效液相色谱仪器二、主要部件（mainassemblyofHPLC）第二节高效液相色谱仪器4（6）个主要

6、部分：高压输液系统；脱气装置；梯度洗脱；进样系统；分离系统；检测系统；此外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。第二节高效液相色谱仪器1．高压输液系统由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。高压输液泵核心部件。压力：150～350×105Pa。应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。第二节高效液相色谱仪器第二节高效液相色谱仪器常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵特点：在一定操作条件下，输

7、出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵特点：能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。第二节高效液相色谱仪器输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。几种输液泵的基本性能见下表。名称恒流或恒压脉冲更换流动相梯度洗脱再循环价格气动放大泵恒压无