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1、如何用好HPLC…得到好结果的技巧!流动相缓冲液/溶剂选择,梯度优化,流速选择脱气，流速稳定,流动相制备柱高柱效,二级作用力,柱间变异,温度控制检测灵敏度,选择性,温度波动影响样品提取方法选择,样品溶剂选择,氧气影响仪器性能,稳定性,耐用性,易操作性综合评估分析技术的稳定性,可靠性,定量准确性HPLC如何得到好的结果…流动相溶剂混和率及其制备(1)下面的两种配制一样吗?水/乙醇=1/1(v/v)50%(v/v)乙醇水溶液*混和有机溶剂时注意体积变化混和液的密度不是两种溶剂密度的简单相加.25ºC时，50mL水和50ml乙醇混和,最终体积为96ml.水/乙醇=1/1(v/v)分别
2、量取500ml水和乙醇,然后混和混和体积不是1L.50%(v/v)乙醇水溶液.加500ml乙醇于1L的容量瓶中,加水至刻度.水的比例更高.1LWaterEthanolEthanolWater流动相溶剂混和率及其制备(2)流动相A:20mM磷酸(Na)缓冲液/乙腈=9/1(v/v)流动相B:10%(v/v)乙腈/20mM磷酸缓冲液12331AB2Peaks1:acetaminophen2:dihydrocodeine3:caffeine0246810minColumn:Shim-PackVP-ODS (150mmL.x4.6mmI.D.)Flowrat
3、e:1mL/minTemp.:40ºCDetection:UV-VIS(210nm)流动相溶剂混和率及其制备(3)配制:20mM磷酸缓冲液(pH2.5)流动相缓冲液比例及其制备(1)A:“20mM”表示磷酸浓度加10mmol磷酸和10mmol磷酸二氢钠,溶解于1L水中B:“20mM”表示钠浓度溶解20mmol磷酸二氢钠于1L水中,加磷酸调pH至2.5C:“20mM”表示磷酸和钠的浓度,用高氯酸调节pH溶解20mmol磷酸二氢钠于1L水中,用高氯酸调节pH至2.5Column:Shim-PackVP-ODS (150mmL.x4.6mmI.D.)Flowrate:1mL
4、/minTemp.:40ºCDetection:UV-VIS(210nm)流动相A:磷酸浓度为20mM流动相B:钠浓度为20mM流动相C:磷酸，钠浓度均为20mM,用高氯酸调节pH流动相缓冲液比例及其制备(2)min12331AB2Peaks1:acetaminophen2:dihydrocodeine3:caffeine0246810C31,2不一样的解释…Dihyrocodeine出峰位置不一样流动相缓冲能力弱…pKa与流动相pH相近的酸和碱的峰形变差.Column:STRODS-II (150mmL.x4.6mmI.D.)Mobile:20mMbuffersolution
5、(pH4.5) phase/acetonitrile(3/1,v/v)Flowrate:1mL/minTemp.:40ºCDetection:UV-VIS(240nm)左图:柠檬酸缓冲液pH(4.5)作流动相右图:磷酸缓冲液(pH4.5)作流动相流动相pH缓冲能力和峰形吸光度HPLC级的乙腈在UV低波长有很低的吸收HPLC级的乙腈适用于UV低波长下高灵敏度的分析!柱压乙腈更低.相同流速下,引起的柱压更低.洗脱能力乙腈更强.一些化合物甲醇容易洗脱.(胡萝卜素,胆固醇)选择性不同.峰形不同.聚合物基底的柱子,乙腈更好.流动相脱气效率与水混和时要注意甲醇……发热气体溢出
6、乙腈…吸热气体溶解流动相甲醇和乙腈的不同保留时间改变峰面积改变定量错误!!对绝对量响应的检测器流速不影响峰面积.对浓度响应的检测器流速影响峰面积.*几乎所有的LC检测器均为浓度型检测器流动相流速变化的影响(1)1.009729145912886547n-butylparaben1.009826520872626362n-propylparaben1.009627710872744605ethylparaben1.009539382133901107methylparabenB/AB(0.99mL/min)A(1.00mL/min)面积比峰面积Column:Shim-
7、PackVP-ODS(150mmL.x4.6mmI.D.)Mobilephase:methanol/water=6/4(v/v)Flowrate:A;1.00mL/minB;0.99mL/minTemperature:40ºCDetection:UV-VIS(260nm)流动相流速变化的影响(2)两台泵进行混和时…ABA:一台泵输送预先混和好溶剂B:两台泵分别输送两种溶剂并混和Peaks1:methylparaben2:ethylparaben3:propylpa
