HPLC高效液相色谱实验讲义

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1、高效液相色谱法海南大学材料与化工学院周雪晴一.色谱法概述二.高效液相色谱法（原理、相关术语、分类）三.高效液相色谱仪（仪器结构与原理）四.色谱的定性定量分析五.奶粉中三聚氰胺测定实例六.液相色谱分析方法的开发工作原理用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号或进行数据处理而得到分析结果。样品组分分离示意图色谱术语：色谱图、保留时间、死时间、峰高、峰面积、峰宽、半峰宽、分辨率、柱效

2、、塔板数色谱分析可以认为进入柱子内的样品成分在流动相中是呈“正态分布”的，我们可以根据tR（峰的位置〕来定性；根据峰面积或峰高（h）来定量。无保留物质HPLC系统构成进样系统流动相供应系统自动进样器储液溶剂输瓶送系统手动色谱柱进样阀数据采集处理系统检测器废液瓶定量分析1.归一化法(NormalizedPercent)2.外标法(ExternalStandard)3.内标法(InternalStandard)定量分析归一化法定量将试样中所有组分的含量之和按100％计算，以它们相应的色谱峰面积为定量参数。

3、如果试样中所有组分均能流出色谱柱，并在检测器上都有响应信号，都能出现色谱峰，可用此法计算各待测组分X的含量。其计算公式如下：定量分析例：分析乙醇、庚烷、苯及乙酸乙酯的混合物。实验测得它们的色谱峰面积各为5.0、9.0、4.0、及7.0cm2，由手册查得它们的相对重量校正因子FＷ分别为0.64、0.70、0.78及0.79，按归一化法分别求它们的重量百分浓度。5.00.64（1）乙醇%=100%5.00.649.00.704.00.787.00.793.20100%18.1517

4、.6%9.00.70（2）庚烷=100%34.7%18.15定量分析内标法定量准确称量样品的重量为m克，取一纯物质（内标物）适量，加入其中，并准确称量内标物重量为ms克，混匀，进样。测量色谱图上需定量的i组份的峰面积Ａi及内标物的峰面积Ａs，则i组份在样品m中所含的重量mi，与内标物质的重量ms，有下述关系：miAifm(i)Cmii%100%mAsfmsm(s)Afm。C%imis100%iAsfmms只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百

5、分含量。定量分析例：无水乙醇中的微量水的测定可按下述方法进行：样品配制准确量取被检无水乙醇10ml称重（净重）为79.3700g。用减重法加入无水甲醇约0.25g，精密称定为0.2572g，混匀待用。经色谱分析测得数据如下：水：h=4.60cm，Wh0.130cm2W0.187cmh甲醇：h=4.30cm2计算：（1）重量百分含量：用以峰面积表示的相对重量校正因子fHO0.55；f甲醇=0.58计算：21.0654.60cm0.130cm0.550.2572gHO%

6、100%0.228%(W/W)21.0654.30cm0.187cm0.5879.3700g外标法定量比较相同分析条件下纯样（标准样品）与样品中该组份色谱峰面积或峰高，进行定量的分析方法称为外标法。也被称为定量进样校正曲线法，或定量进样法。此方法是在进样量、色谱仪器及操作等分析条件严格固定不变的情况下，先将不同含量的组份纯样等量进样，进行色谱分析，求得含量与色谱峰面积或峰高的关系，将此关系绘成定量校正曲线，而后在同样条件下分析待测样品，测量待测样品的峰高或计算峰面积，并以此在校正曲线上求

7、出样品含量。外标法定量当被测样品中各组份浓度变化不大时，例如工厂中控制分析的样品，其组成一般变化不大，可以不必做校正曲线，用单点校正法来分析。即配制一个和被测组份含量十分接近的标准样，在同一条件下定量进样分析标准样及待测样品，由两者的峰高比或峰面积比计算未知样品含量。AmmisiAs五、奶粉中三聚氰胺测定实例奶类制品中的三聚氰胺?伊利雪糕、四洲甜点、乐天蛋糕、大白兔奶糖、雀巢牛奶、立顿三合一奶茶、亨氏米粉、吉百利巧克力„„样品前处理过程及设备氮吹第六章液相色谱分析方法1、色谱柱的选择根据被分离物质的

8、化学结构、极性和溶解度等因素进行选择。①大多数药物可用C18反相（ODS）柱加以分离测定；②也可选用正相分配色谱柱（氨基柱、氰基柱）或硅胶吸附色谱柱等；③解离药物可用离子对色谱、离子抑制色谱或离子交换色谱分离测定；④脂溶性药物异构体的分离测定可采用硅胶吸附色谱柱。2、流动相的选择1）反相键合相色谱反相键合相色谱常用流动相流动相常用溶剂适用范围部分含水溶剂甲醇-水、乙腈-水系统用于分离中等极性、弱极性药物非水溶剂乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氢呋喃用于分离疏水性