纸层析法分离氨基酸.doc

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1、纸层析法分离氨基酸班级姓名：学号：同组同学：实验日期：一、实验目的1、掌握分配层析的原理，学习氨基酸纸层析法的操作技术2、学习未知样品的氨基酸成分(水解、层析及鉴定)分析的方法。二、实验原理用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。纸层析所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下而上移动，称上行法；由上而下移动的，称为下行法。将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于他们分配系数不同，不同氨基酸随流动相的移动速度就不同，于是将各种氨基

2、酸分离开，形成距离远点距离不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用值表示：只要条件不变，值是常数，故可以根据值作定性依据。样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的值相同或相近，此时如用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动，再用另一种展层，从而就达到分离的目的，这种方法称为双向纸层析法。氨基酸无色、利用茚三酮反应，可将氨基酸层析点显色作定性和定量。二、实验器材和药剂1、实验试剂1、氨基酸标准液(1mg/mL)亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。2、80%甲酸3、0.1%茚三酮丙酮溶液4、氨基酸混合液5、正丁醇6、蒸馏水2、仪器1、新华滤纸

3、2、培养皿3、电热鼓风干燥箱4、吹风机5、毛细管6、针、线、尺。7、钟罩二、实验步骤1、滤纸：选用国产新华1号滤纸，6cm×7cm。在距滤纸2cm处划线，用铅笔在线上标上四个点作为点样位子2、点样：点样要合适，样品点的太浓，斑点易扩散或拉长，以致分离不清。用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处的中心，这时样品就自动流出。点样的扩散直径控制在0.5cm之内，点样过程中必须在第一滴样品干后再点第二滴，为使样品加速干燥，可用吹风机吹干，但要注意温度不可过高，以免氨基酸破坏，影响定量结果。3、将点好样品的滤纸两侧比齐，用线缝好，揉成筒状。注意缝线处纸

4、的两边不要接触。避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动特别快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值。1、展层：将揉成圆筒状的滤纸放入培养皿内(注意滤纸不要碰皿壁)，当溶剂展层至距离纸的上沿约1cm时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿位置2、酸溶剂系统：正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2(体积比)，茚三酮2ml。温度25℃，时间1h。3、显色：待展层基本结束后,置65℃鼓风箱中10-20min，鼓风保温，滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。4、E、Rf值的计算：用尺测量显色斑点的中心与原点(点样中心)之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，求出此值，即得氨基酸的Rf值。五、数据处理

5、和计算亮氨酸甘氨酸脯氨酸待测氨基酸原点到层析点中点距离5.9cm1.5cm2.5cm1.62.65.9原点到溶剂最前沿距离8.0cm8.0cm8.0cm8.0cm0.73750.21430.31250.20.3250.7375判断待测氨基酸待测氨基酸应为亮氨酸，甘氨酸脯氨酸的混合物六、思考与讨论1、为什么在展层时有时用一种溶剂系统，而有时用两种溶剂系统?答：在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中的Rf比较接近，不易明显分离时，应用这种方法，如果溶质在第一溶剂中不能完全分开，而经过第二种溶剂的层析能得以完全分开，大大的提高了分离效果。2、酸性溶剂系统(或碱

6、性溶剂系统)对氨基酸极性基团的解离有何影响?答：酸性溶液中，有利于氨基酸的碱式电离，氨基结合质子，整个分子带正电荷；反之，碱性溶液中有利于羧基的酸式电离，氨基酸分子整体带负电荷3、酸性溶剂系统(或碱性溶剂系统)对碱性氨基酸(赖、精、组)和酸性氨基酸(天冬、谷)的Rf值有什么影响?答：你往溶剂系统中对于加入碱，对于酸性氨基酸来说，羧基会更多的解离，自然Rf降低。而对于碱性氨基酸的盐溶液来说，解离度降低，Rf增大。你往溶剂加酸，对于酸性氨基酸来说，羧基变化不大，氨基接受质子更多解离，Rf降低。对于碱性氨基酸，解离度增大，Rf也减小4、什么是分配系数？答：当溶质在

7、两种互不兼容的溶剂中分配时，在温度达到一定平衡时，溶质在两相的浓度比值，,有效分配系数，分别代表A相和B相的体积。注意事项：使用茚三酮显色法，必须在整个层析操作中避免手直接接触层析纸，因为手上常常有少量含氮物质。显色时它也呈现紫色斑点。污染了层析结果，因此操作时应戴橡皮手套或指套。同时也要防止空气中的氨。七、从结果中所得到的的心得在做实验前,一定要将课本上的知识吃透,因为这是做实验的基础,否则,在老师讲解时就会听不懂,这将使你在做实验时的难度加大,浪费做实验的宝贵时间老师还会根据自己的亲身体会,将一些课本上没有的知识教给我们,拓宽我们的眼界,使我们认识到这门

8、课程在生活中的应用是那么的广泛.真正是我们受益匪浅。