实验一 大肠杆菌的分离和培养.ppt

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1、实验1大肠杆菌的培养和分离实验目的：1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基本进行细菌的划线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。一、基础知识(一)微生物:1.特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.2.微生物包括五类病毒细菌放线菌真菌原生动物(二)培养基1.分类(按物理形态分)(1)液体培养基(2)固体培养基常用的固体培养基:琼脂固体培养基.②微生物

2、在固体培养基表面生长,可以形成肉眼可见的菌落.2.培养基内所含的基本物质(1)水(2)碳源(3)氮源(4)无机盐3.培养基内所需的其他条件(1)pH值如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性(2)特殊营养物质----?如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素(3)氧气的含量如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件生长因子(三)无菌技术1、获得纯净培养物的关键:2、无菌技术的四个方面(参看教材20页)3、消毒与灭菌(1)消毒：概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢和孢子

3、吗？方法:煮沸消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等紫外线消毒(不包括芽孢和孢子)防止外来杂菌的入侵（2）灭菌概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a灼烧灭菌b干热灭菌c高压蒸汽灭菌灼烧灭菌微生物的接种工具(接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧注意适用范围干热灭菌160－170℃；1－2h能耐高温的需要保持干燥的物品(玻璃器皿)高压蒸汽灭菌100kPa121℃15-30min通常用于培养基的灭菌二、实验操作（一）制备牛肉膏蛋白

4、胨固体培养基计算－称量－溶化－灭菌－倒平板（二）分离纯化大肠杆菌接种方法有：划线分离法和涂布分离法（三）将接种后的培养基和一个未接种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h和24h后，观察并记录三、课题延伸：菌种的保藏1、斜面保藏（临时保存）2、甘油保藏（长期保存）实验1：大肠杆菌的培养和分离设备及用品：灭菌锅或高压锅、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、直径90mm的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有棉塞的试管（15mm×120mm）5支实验材

5、料：(1)50mlLB液体培养基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、NaCl0.5g、加水50ml。(2)大肠杆菌菌种斜面(3)空白斜面实验步骤(1)灭菌：将配制好的50mlLB液体培养基和50mlLB液体培养基分别装入两个250ml的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。(2)制平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成平面。(3)接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三角烧瓶的液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养12h。(4)划线分离：将摇床上培养1

6、2h的菌液在固体培养基的平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在37℃恒温培养箱中进行培养。(5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h,4℃冰箱保存。单菌落实验讨论实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭菌后在超声波清洗器中加洗

7、衣粉洗涤纶30min,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可再用。无菌技术的四个方面（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。(三)无菌技术返回倒平板讨论:(1).培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？(2).为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？(3).平板冷凝后，为什么要将平板倒置？(4).在倒平板的过程

8、中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？提示：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可