实验一大肠杆菌的培养和分离ppt课件.ppt

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1、实验1大肠杆菌的培养和分离1大肠杆菌革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌，在肠道中一般对人体无害，但也有一些菌株是对人体有害的，可以侵袭肠粘膜并产生毒素。但是，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌也是基因工程技术中被广泛采用的工具。它以分裂方式繁殖，分裂速度较快。革兰氏染色：是一种通过对细菌进行染色从而达到鉴别细菌的方法。依据的原理是细菌的细胞壁结构不同，据此可以分为两种：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。染色结果：革兰氏阳性菌染色后用酒精脱色不变色，复染后呈紫色；革兰氏阴性菌染色后用酒精脱色会变色，复染后呈红色。兼性厌氧：既可以在有氧条件下进行新陈代谢，又可

2、以在无氧状态下进行新陈代谢。但在这两种状况下，体内的生化反应是不同的，也就是说产能途径不同。2单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。培养皿涂布杂菌形成的菌落（一）菌落划线法形成的菌落3（二）培养基由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。LB（Luria-Bertani）液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取液5g/L，氯化钠10g/L。配制50mL的LB培养基：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加50mL水溶解。LB（Luria-Bertani）固体培养基：50mlLB（Luria-Bertan

3、i）液体培养基中再加入1g琼脂制得。固体培养基可根据需求制成平面或斜面。（可用于大肠杆菌的扩大培养）（可用于大肠杆菌的划线分离）通用的细菌培养基：细菌培养基需求中性偏碱，霉菌培养基需求中性偏酸。4LB液体培养基：细菌在液体培养基中扩大培养5LB固体培养基倒入平板，用于分离细菌制成斜面，用于保存细菌6划线分离涂布分离单菌落更易分开操作简单操作复杂（三)细菌的分离7（三）无菌技术泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。1、消毒：是指杀灭大部分病原微生物的方法。（1）100℃煮沸5-6min（2）巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min（3）用75%

4、酒精等进行皮肤消毒（4）紫外线消毒常用消毒方法：8（1）灼烧灭菌2、灭菌：是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的方法。9（2）干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。（3）高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.10针对不同的实验器材或材料选择不同的灭菌方式：各种器皿（如培养皿、三角瓶、取样器的头等）：高压蒸汽灭菌法灭菌后放入60-80℃的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分。在进行实验前，需将要使用的器具从烘箱中取出，放在超净工作台上，打开紫外灯和过滤风，灭菌30min。培养基：一般121℃灭菌15min有葡萄糖：500g/cm2（90℃以上）

5、灭菌30min有尿素等不能加热的物质：G6玻璃砂漏斗（玻璃砂漏斗用后需用1mol/L的HCl浸泡，抽滤去酸）进行操作时，注意瓶口、壁上等不能沾有培养基，否则易发生污染。11大肠杆菌的培养和分离实验操作步骤12实验器材13141516培养基（微生物生存的环境和营养物质）LB液体培养基大肠杆菌菌种斜面空白斜面17（一）培养基的制备与灭菌取两个250ml的三角瓶，分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，用牛皮纸包装后放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。LB液体培养基——细菌的扩大培养LB固体培养基——细菌的划线分离18（二）倒平

6、板待灭菌后的固体培养基冷却到60℃时，在超净台上分别将培养基倒入4个培养皿中，每倒入一个培养皿后立即将培养皿置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝固后形成平面。无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒操作时右手无名指和小指夹住封口膜，另外三指持三角瓶，左手拿培养皿并打开上盖的一边，在酒精灯火焰旁操作。19（三）大肠杆菌的接种将斜面上培养的大肠杆菌菌种用接种环接种到灭菌后的LB液体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。注意事项:1.在火焰旁从斜面上用接种环取菌;2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌，冷却后方能取菌；3.接种时右手拿着接种

7、环，右手无名指和小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜；4.取菌后封口膜和棉塞复原.20三角瓶在37℃，每分钟200转的摇床上振荡培养12h。（四）大肠杆菌的扩大培养21（五）大肠杆菌的划线分离1、操作步骤（1）灼烧接种环；（2）接种环冷却后，从在摇床上培养了12h的菌液中蘸取菌液；（3）在近火焰处，用带菌液接种环在固体培养基上划线。22划线分离、培养、菌种保存划线后盖好培养皿，将培养皿倒置在37℃恒温培养箱中培养12-24h划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种