(讲课)基因工程的基本操作程序.ppt

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1、基因工程的基本操作程序1、目的基因的选择获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤:有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。一、目的基因的选择获取:1、目的基因:主要是编码蛋白质的结构基因;也可以是具有调控作用的因子。2、获取目的基因的常用方法有哪些?从基因文库中获取。利用PCR技术

2、扩增；化学方法直接合成。人工合成：从已有的物种中分离：把需要研究的基因称为目的基因。基因工程所述的目的基因：（一）、从基因文库中直接获取：1.什么是基因文库？将某一物种的生物不同的基因许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存起来，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，由这些含有不同基因片段的受体菌群组成的基因总和称为基因文库。2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类种类基因组DNA文库：含有一个物种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一个物种生物的部分基因，如：cDNA文库3.如何构建基因文库或构建基因文库遵循原则：简单的说：就是根据目的

3、基因的有关信息进行分类。如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、以及基因翻译产物等特性来构建基因文库。4.构建基因文库的方法：①直接分离法(鸟枪法)：②反转录法：提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库①.直接分离法(鸟枪法)某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶②反转录法：cDNA的合成流程图解基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较：文库类型cDN

4、A文库基因组文库文库大小较小较大基因中有无启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以5.如何从基因文库中寻找目的基因：简单的说：根据建立基因文库时的分类索引来寻找。如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、以及基因翻译产物等特性来构建基因文库。原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游不能编码蛋白质可调控遗传信息的表达(调控序列)编码蛋白质(编码序列)原核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点RNA聚合酶是

5、由多个肽链构成的蛋白质，能识别并与调控序列中的结合位点结合,催化转录形成RNA。与RNA聚合酶结合位点AGGUCACGUCGAGGTCACGTCGTCCAGTGCAGCRNA聚合酶RNA聚合酶RNA聚合酶真核细胞的基因结构一个典型的真核细胞基因结构示意图编码区含有：能够编码蛋白质的序列(外显子)不能编码蛋白质的插入序列(内含子)非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区编码区下游调控遗传信息的表达(调控序列)外显子(能编码蛋白质)内含子(不能编码蛋白质)非编码区非编码区编码区与R

6、NA聚合酶结合位点外显子内含子12345加工转录前体RNAmRNA加工一个典型的真核细胞基因结构示意图非编码区非编码区编码区与RNA聚合酶结合位点外显子内含子12345原核细胞基因真核细胞基因相同点不同点原核细胞基因与真核细胞基因的比较都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成。编码区是连续的编码区是间隔的，是不连续的1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的（）A、染色体DNA  B、线粒体DNAC、总mRNA  D、tRNA2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是（）A、某生物的全套基因就是一个基因文

7、库；B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库；C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库；D、含有一个生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库。AC（二）利用PCR技术扩增目的基因：是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。PCR——聚合酶链式反应:PCR技术:PCR扩增仪DNA双链复制一段已知目的基因的核苷酸序列模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子.原理：前提：原料:过程：高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单

8、链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）重复循环预变性（增加DNA变性的概率）PCR技术具体过程：a、高温DNA变性（90℃-95℃）：