《 基因工程的基本操作程序》.ppt

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1、1.2基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是______________________编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库

2、中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成一、目的基因的获取（一）从基因文库中直接获取1.基因文库：2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类种类基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库3.基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。4.获取目的基因的根据：提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库5.基因文库的构建方法之一（1）直接分离法(鸟枪法)某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体

3、菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶反转录法：cDNA的合成流程图解5.基因文库的构建方法之基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术聚合酶链式反应体外特定DNA片段原理：DNA复制2、利用PCR技术扩增目的基因四种脱氧核苷酸(dNTP)一对引物：热稳定DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)Mg2+(激活剂)条件：缓冲溶液一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引

4、物前提：过程高温变性（解旋为单链）低温退火（引物与单链互补结合）适温延伸（在Taq酶的作用下合成与模板互补的DNA双链）重复循环预变性（增加DNA变性的概率）2、具体过程PCR(多聚酶链式反应)①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、_______________、___________、___________.等②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：聚合酶链式反应体外特定

5、DNA片段DNA复制四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对

6、四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测推测化学合成2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：3、人工合成的目的基因二、基因表达载体的构建——基因工程的核心1、目的：所需物质：使目的基因

7、在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。它们各自的作用是什么?2、基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们各自的作用是什么?启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的

8、基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到