《基因工程的基本操作程序》.ppt

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1、基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取（前提）2、基因表达载体的构建（核心）3、将目的基因导入受体细胞（关键）4、目的基因的检测与鉴定（保证）一、目的基因的获取获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）利用人工合成（DNA合成仪）概念：基因文库（genelibrary）基因组文库部分基因文库（如cDNA文库）将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库基因文库中包含了一种生物所

2、有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.(1)从基因文库中获取目的基因基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？依据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因的表达产物蛋白质方法：“鸟枪法”又名“霰弹法”---核酸探针PCR技术聚合酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。原理：前提：条件PCR扩增

3、仪DNA复制一段已知目的基因的核苷酸序列（便于合成引物）方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）指数2n模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸（原料）；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；（2）利用PCR技术扩增目的基因过程变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90～95℃双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸（3）人工合成法DNA合成仪根据已知的氨基酸

4、序列合成DNA蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成mRNA反转录单链DNADNA聚合酶双链DNA反转录法：化学合成法：缺点：由于一种氨基酸可由多种密码子决定，故推测的基因可能为新基因，专一性不强优点：操作简单缺点：mRNA生存时间短，技术要求高，操作麻烦优点：专一性强，准确从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用人工合成归纳：获取目的基因的方法2构建载体二、基因表达载体的构建——核心（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出_______

5、_____。（2）用___________切断目的基因，使其产生_________________。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同1.过程:质粒目的基因限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶表达载体同种1.过程:（重组载体）2.基因表达载体的组成：它们有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是RNA聚合

6、酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA.位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。三、将目的基因导入受体细胞—关键1、将目的基因导入植物细胞（1）农杆菌转化法特点:能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力Ti质粒的T—DNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色体DNA表达新性状转

7、入农杆菌（2）基因枪法基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。（3）花粉管通道法植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。2、将目的基因导入动物细胞方法:显微注射技术操作程序:提纯含目的基因表达载体取受精卵显微注射移植到子宫受精卵发育新性状动物注入3、将目的基因导入微

8、生物细胞常用法：Ca2+处理常用菌：大肠杆菌微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少过程：Ca2+处理大肠杆菌感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA(四)目的基因的检测与鉴定—保证检测①导入检测：目的基因是否导入受体细胞染色体DNA上方法——DNA分子杂交②表达检测转录检测——分子杂交翻译检测——抗原抗体杂交分子检测法鉴定抗虫鉴定抗病鉴定活性鉴定等个体水平的鉴定知识延伸——DNA分子杂交技术该方法是根据碱基互