猪伪狂犬病病毒山西株胸苷激酶基因序列分析.pdf

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1、·12·生物技术中国畜牧兽医2014年第41卷第4期猪伪狂犬病病毒山西株胸苷激酶基因序列分析樊振华，孟帆。吴忻，刘文俊，姚敬明，王娟萍，韩一超。米瑞娟，雷宇平(1．山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原030032；2．山西省动物疫病预防控制中心，山西太原030024)摘要：采用PCR方法对2011—2013年山西省分离的2株猪伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，PRV)的胸苷激酶(TK)基因进行了克隆和测序，并将其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外主要流行毒株Bartha株、Beck

2、er株、Ea株、Kaplan株、LA株、Mir卜A株、NIA一3株、SH株、SL株和Yangsan株进行了同源性分析。序列分析结果表明，核苷酸同源性分别为99．7、99．6、99．8、99．7、99．7、94．4、99．1、57．2、99．5、99．7；氨基酸同源性分别为99．1、99．1、99．7、99．4、99．4、90．3、98．1％、49．7、98．8、99．1。另外在核苷酸序列中起始密码子上游有3段GCbox的序列，终止密码子下游有多聚腺苷加尾信号AATAAA；TK基因均由320个氨基酸组成

3、，氨基酸序列中有疱疹病毒TK基因共同的保守序列一R*Y*DG**G*GK*T一和一FDRHP*A***C*P*AR一。关键词：猪伪狂犬病病毒；TK基因；变异分析中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：1671-7236(2014)040012—06猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(pseudorabies防控提供理论依据。virus，PRV)引起的一种高度接触性传染病。自1材料与方法1902年匈牙利首次发现该病以来已广泛分布于世1．1PRV的来源及处理2011—2013年采自山界各地，50多个国家和地区

4、均已报道过该病的流西省太原、晋中、忻州、运城等不同地区疑似猪伪狂行。中国自1984年刘永纯首次报道此病后，迄今为犬病发病猪场。对发病猪及病死猪进行剖检，观察止已有20多个省份相继发生该病，并在许多种猪场并记录病理变化。无菌采取剖检猪的脑、脾脏、肺脏呈暴发流行趋势，给中国的养猪业特别是集约化养等作为检测PRV的材料，于一70℃保存备用。样猪场造成了巨大经济损失(殷震等，1997；中国农业品经PCR鉴定为PRV阳性，猪繁殖与呼吸综合征科学院哈尔滨兽医研究所，1999)。PRV基因组为病毒(PRRSV)、猪

5、圆环病毒(PCV)、猪细小病毒线性双股DNA分子，约150kb，至少包括7O多个(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪肺炎支原体(Mhp)阴基因，大部分为非必需基因。其中胸苷激酶(thymi—性，于一70℃保存备用。取适量PRV阳性病料加dinekinase，TK)基因是PRV的主要毒力基因和非1OmLPBS制成组织匀浆，然后加入双抗(2000必需基因(陈瑞爱等，2010)，也是病毒化学治疗和缺U／mL)，反复冻融3次，12000r／min离心30min，失致弱疫苗的主要靶基因(琚春梅等，2005；吴凤

6、笋取上清液，经0．22Fm滤膜除菌后，取1mL接种于等，2006)。因此对TK基因进行序列分析，在一定长成单层的PK一15细胞，37℃吸附1h，弃上清，用程度上可反映PRV的毒力情况。2011～2013年Hank’S液洗涤3～4次，然后加入1OmL维持液，在山西发病猪群中分离出2株PRV，对其进行了置于5CO。的培养箱中37℃继续培养。接毒TK基因遗传变异分析，从分子生物学的角度分析12h后开始每6h观察1次致细胞病变效应山西省流行毒株与国内外其他毒株间的关系，以(CPE)，共观察72h。盲传3代，出

7、现典型CPE者探求山西PRV毒株变异情况，为其亲缘关系、减继续传代至CPE稳定出现，当出现80以上细胞毒机理和分子流行病学调查的研究积累资料，并病变时收获病毒液。为其基因工程缺失疫苗或重组疫苗的研制提供详1．2主要试剂TRIZOLLSReagent购自In—细的分子生物学背景，进而为今后猪伪狂犬病的vitrogen公司；TaKaRaMiniBESTViralRNA／DNAExtractionKitVer．4．0和TaKaRaIA收稿日期：2013-09—25PCR。。KitVer．2．1试剂盒均购自T

8、aKaRa公司；作者简介：樊振华(1964一)，男，山西人，学士，副研究员，研究方DNA胶回收试剂盒、普通质粒小量提取试剂盒均购向：畜禽传染病。通信作者：孟帆。E-mail：jcbyjs@sohu．corn自上海生工生物工程技术服务有限公司；PRRSV基金项目：山西省科技攻关项目(20110311034—3)。鉴别RT—PCR检测试剂盒及CSFV、Mhp、PPV、中国畜牧兽医2014年第41卷第4期生物技术·13·PRV和PCVPCR检测试剂盒均购自北京