小RNA转染人外周血原代T淋巴细胞的转染试剂筛选.pdf

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1、中国医药生物技术2014年10月第9卷第5期ChinMedBiotechnol，October2014，Vo1．9，No．5·论著·DOI：10．3969／cmba．j．issn．1673—713X．2014．05．001小RNA转染人外周血原代T淋巴细胞的转染试剂筛选张群，庞国进，刘天会，王萍，马雪梅，尤红，丛敏【摘要】于原代悬浮细胞，化学合成的siRNA转染进入目的探讨人工合成RNA转染人外周血原代T淋巴细细胞的转染效率较低【6】。已有研究报道可采用胞的有效方法。Lipofectamine2000和LipofectamineRNAiMA

2、X方法从人外周血分离原代T淋巴细胞，采用Lipofectamine将化学合成的siRNA转染进入原代细胞或悬浮细胞【。FuGENE6、Hiperfect和EntransterTM-R依2000、LipofectamineRNAiMAX、FuGENE6、Hiperfect和EntransterTM-R5种不同转染试剂介导荧光标记的RNA转其试剂盒说明书也可进行原代细胞siRNA的转染原代T淋巴细胞，通过荧光显微镜观察及流式细胞术检染。为探讨不同转染试剂的转染效率，我们采用测进行转染效率评价。上述5种转染试剂介导荧光标记的对照RNA转染人外周血

3、T淋巴细胞，筛选出介导RNA转染结果分离的人外周血原代T淋巴细胞的纯度达到人外周血T淋巴细胞效率较高的转染试剂87．4％。采用上述5种转染试剂介导荧光标记的RNA转EntransterTM-R染T淋巴细胞，24h后转染效率分别为(14．814-1．03)％、，证明其能够有效介导人工合成RNA转染人外周血原代T淋巴细胞，可作为今后(14．334-1．24)％、(2．104-0．16)％、(1．694-0．08)％、(72．244-1．26)％。采用EntransterTM-R转染100及进行特定基因的siRNA转染原代T淋巴细胞的实验依据。5

4、0nmol／L对照RNA，24h后转染效率分别为73．7％和56．0％；EntransterTM-R转染100nmol／L对照RNA后48、72h荧光标记细胞阳性率分别为62．0％、56．6％。1对象与方法1．1研究对象和材料结论转染试剂EntransterTM-R可有效介导人工合成1．1．1对象本研究共采集l0例健康志愿者，RNA转染人外周血原代T淋巴细胞。由同例志愿者的T淋巴细胞完成同组实验，所有【关键词1RNA干扰；转染；T淋巴细胞实验均通过医院伦理委员会批准并取得献血者的www．cmbp．netcn中国医药!物技术2014,9(5)

5、．'321．327知情同意书。1．1．2主要试剂RPMI1640培养基和胎牛血清mRNA发生特异性降解，导致靶基因表达抑制均购自美国Gibco公司；淋巴细胞分离液(Ficoll或沉默，引起相应的功能表型缺失，属于转录后的液)购自美国GEHealth公司；人T细胞富集基因沉默机制】，在各个领域的特定基因沉默研究液购自美国StemCell公司；CD3抗体购白美国中应用广泛J。双链RNA即小干扰RNA(smallBD公司；荧光标记的siRNABLOCK—iTTMAlexainterferingRNA，siRNA)，通过引入双链RNA引Fluor~

6、RedFluorescentOligo(对照RNA)，转染发特定靶基因沉默，比基因敲除技术更方便、快捷试剂Lipofectamine2000、RNAiMAX均购白美地显示出基因的功能，已成为分子生物学领域最热国Invitrogen公司；转染试剂FuGENE6购自美国门的研究课题之一J。T淋巴细胞是发挥机体免疫功能最重要的一基金项目：国家自然科学基金(81000172、81370544)；北京市自然科大细胞群，具有促进或者调节机体细胞免疫及体液学基金(7142043)；王宝恩肝纤维化研究基金(20120131)免疫的功能。通过siRNA的方法

7、干扰人外周血原作者单位：100050北京，首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心(张代T淋巴细胞特定基因的表达，从而抑制T淋巴群、庞国进、刘天会、王萍、尤红、丛敏)，肝硬化转化医学北京市重点实验室(张群、庞国进、刘天会、王萍、尤红、丛敏)，普外科(马细胞相应的功能或表型，对于研究T淋巴细胞特雪梅)定基因的功能以及对T淋巴细胞功能的临床干预通讯作者：丛敏，Email：maomao0623@sina．tOm等具有重要意义。但是，人外周血T淋巴细胞属收稿日期：2014．02-24322司医药牛物技术2O14年10f]第9巷第5期ChinMedBio

8、technol，Octobcr2014．Vol9．No．5Promega公司：Hiperfect购自德Qiagen公司；l0％(体积分数)胎牛血清]II，，以2×l0个／孔转染试