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《_胰凝乳蛋白酶在胍溶液中的变性_失活_复性_复活》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、马1生物物理学报一0。。。笼卷浇期1马N3ACTABIOPHYSICASINICAr.1989年月、丁a1989a一胰凝乳蛋白酶在服溶液中的变性、失活、复性、复活姜淑仙练永宁(中国科学院生物物理研究所)摘要前已报导,在眠或呱的作用下,叭酸激酶失活速度远快于酶分子整体构象变化的速度。本文报导又用在变性剂存在下研究底物反应的方法对分子较小,由单亚基组成,件有五个二硫键使分子结构更加稳定的胰凝乳蛋白酶,在盐酸呱作用下的变性,失活,。结果表明以及相应的复性复活进行动力学的比较失活仍快于构象变化速度,复活慢于构象的恢复速度。实验结果还表明已经充分复活的酶和未经变性的酶在
2、片浪巾的构象存在着某些差别.引言利用变性剂有控制地改变酶蛋白在溶液中的构象,从而研究其相应的生物功能变化,。,是研究酶结构和功能关系的重要方法过去研究构象变化过程中酶活性的变化系采用定时取样逐个测定的方法。这不仅工作量大而且对于活性变化快的过程根本无法应用。妇是仁‘;〔2’,,根据邹承鲁等所建立的在变性剂或抑制剂存在下底物反应的动力学分析使得活性变化的快过程的测定成为可能。用这种方法,测定了在脉或肌的作用下,肌酸激酶的失活速度,发现它远快于酶分子一〔忍i〔”。丧明肌、整体构象变化速度酸激酶的活性部位刘变性剂的作用十分敏感活性部位可。。能处于表面或接近分子表面的位
3、置肌酸激酶是由两个分子量为42K的亚基组成的大分子,,,因此对于那些分子量小结构更稳定的蛋白分子在变性剂作用下构象变化与活力变化的。规律的研究将是很有意义的本文即是对具有5个二硫键使结构稳定的单亚基小酶分子一a一,在。胰凝乳蛋白酶肌作用下构象变化与活力变化的比较研究结果说明其失活速度仍,显著快于酶分子构象变化速度而变性了的该酶分子经稀释复活时其复活速度又慢于构象。恢复速度材料和方法、一酶和试剂,a一otrs,,一一enzo-结晶胰凝乳蛋白酶ChymyPin)电泳纯苯甲酞L酪氦酸乙醋(By卜Ltrosoeetester,一一eet一一,rosneethyleste
4、r,,yihylBTEE和乙酞L酪氨酸乙醋(AylL)iATEE)、、、第1期a一胰凝乳蛋白酶在肌溶浓中的变性失活复性复活1。。·.试剂纯,均为上海东风生化试剂Guanidineli,droeliloride),厂产品盐酸肌(分析纯北京,Noza「名’,6M,22m化工厂产品使用前按ki法重结晶两次其水溶液在0n处的光吸收0。。小于l,。。其它试剂均为国产品分析纯实验用水为玻璃重蒸馏水、二方法a一28,‘,‘=.。胰凝乳蛋白酶浓度由0nm处光吸收测定E215。紫外光谱测定在variancary219紫外分光度计上进行使用了自动搅拌装备可测定。。慢速反应(秒级)差
5、光谱测定法见文献〔3〕ox一。快速反应是在DineD115停流装置上测定为了保证高浓度时反应体系的混合均,。匀采用了多道混合装置。有关实验操作见正文全部实验都是在25℃下进行。。数据处理方法及Guggenheim作图法见文献〔3〕结果和讨论一、胰凝乳蛋白,酶变性时所用变性剂服和盐酸肌的比较睬和盐酸脏是使用最多的变。art「“,a一,性剂Min等曾对胰凝乳蛋酶在脉变性时的构象变化进行过仔细的研究但对其。、活力变化研究得少由于肌变性速度快他们使用的方法根本不可能测定快的活性变化过。但就,。,程构象变化与活力变化的比较研究而言肌作为变性剂有其优越性与服相比较一,。低浓
6、度的肌就可使a胰凝乳蛋白酶构象发生很大的变化活力完全丧失从图1可见当肌浓2.5M,。.3M。2.5M度为时酶就完全失活而孤浓度在时酶的活力几乎没有变化因此孤失..eaevesoF191Thriitifa一ehymotrypsin口。任卜%‘inguanidinesolutionoofdifferenteoncen-trations.Theenzymesolutionswereineu-叫刊T无,已p岛口,u。batedwithguanidiniumhydroebloridefor-20minsbeforedeterminationoftheaetivi.:..t
7、yEnzeymceonentration125xl0一5入IM...phosPhate01buffer,PH65123丁heeonCentratonoa一nelifGa一,.,。活的胰凝乳蛋白酶十倍稀释后肛的浓度降至o25M酶的活力就有可能恢复作者实,“”’日,.,验证明在酶浓度10~10M范围内PH65(远低于酶的最适PH)上述稀释过程酌。,一a的活力几乎完全恢复(一95%)作者曾试图使用脉作变性剂进行研究实验表明使胰凝乳M),,o.3M以,蛋白酶失活需较高的脉浓度(6失活速度慢稀释(即便使脉浓度降至下)酶活性的恢复程度很低。当然这(最高为65%)所以脉不适于
8、构象与活力变化的对比研究
