烟草疫霉土壤带菌定量技术规程.pdf

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1、ICS65.160B35DB53/T××××—2020烟草疫霉土壤带菌定量技术规程2020-××-××发布2020-××-××实施云南省市场监督管理局发布DB53/T××××—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。本标准由云南省烟草专卖局（公司）提出。本标准由云南省烟草标准化技术委员会（YNTC12）归口。本标准起草单位：云南省烟草农业科学研究院、云南农业大学、云南省烟草质量监督检测站、云南省烟草公司大理州公司、云南省烟草公司昆明市公司。本标准主要起草人：方敦煌、肖炳光、夏振远、曾建敏、秦西云、童治军

2、、姬广海、孙浩巍、范志勇、徐兴阳。IDB53/T××××—2020引言本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到本标准第4.5条与ZL201510635459.3《一种土壤烟草黑胫病发病潜力的预测方法》相关的专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他同意在公平、合理、无歧视基础上，免费许可任何组织或者个人在实施该地方标准时实施专利。相关信息可通过以下联系方式获得：专利发明人：方敦煌、李永平、肖炳光、曾建敏、童治军专利权人：云南省烟草农业科学研究院地址：云南省昆明市五华区圆通街33号请注意

3、除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。IIDB53/T××××—2020烟草疫霉土壤带菌定量技术规程1范围本标准规定了烟草疫霉菌定量检测以及土壤带菌量等级划分等要求。本标准适用于烟草疫霉菌的定量检测，烟草疫霉菌土壤带菌量等级划分。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T23222烟草病虫害分级及调查方法GB/T23224烟草品种抗病性鉴定GB/T25241.1烟草集约化育苗技术规

4、程第1部分：漂浮育苗GB/T25241.2烟草集约化育苗技术规程第2部分：托盘育苗GB/T25241.3烟草集约化育苗技术规程第3部分：砂培育苗NY/T1121.1土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和储存3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1烟草疫霉菌烟草疫霉菌（PhytophtoranicotianaeBreda）是烟草黑胫病的病原菌，在土壤中以休眠体（如厚垣孢子、菌丝体等）的形态存在，休眠体萌发后形成游动孢子囊，再释放游动孢子侵染烟草。在一个烟草生长季节中能够连续繁殖多代，不断释放游动孢子，通过流水或雨水飞溅传播形成再侵染。4烟草疫霉菌定量检测4.1土

5、样采集与前处理在土地平整后、理墒前按NY/T1121.1采集土壤样品，过2mm筛制备土壤测试样品。4.2土壤稀释平板菌落计数法定量检测4.2.1选择性培养基的制备选择性培养基按照附录A配制。4.2.2土壤稀释平板菌落计数法定量4.2.2.1土壤悬浮液稀释1DB53/T××××—2020称取过筛后的土壤测试样品l0g，放入250mL带塞三角瓶中，再加入已灭菌的40mL0.25%水琼脂，置于漩涡振荡器上充分混匀，5倍系列稀释，每份土样3次重复。4.2.2.2涂布平板-2-3-4吸取5、5、5土壤稀释液各200μL，涂布于选择性培养基平板上，每份样品每个稀释梯度涂布5个平板

6、，置于（24～26）℃恒温培养箱中培养（48～72）h后，疫霉菌在选择性培养基上形成丛状菌落。4.2.2.3菌落计数挑选菌落形态较易区分、菌落数（称为菌落形成单位Colony-FormingUnits，简称cfu）在（5～15）个的平板，标记疑似菌落，将同一样品相同稀释度的5个平板中的菌落数相加计数。每1g土样形成的疑似菌落数计算公式为每1g土壤（干重）中烟草疫霉菌数量＝（同一稀释度3次重复的菌落平均数×稀释倍数）/（1-土壤含水量）4.2.2.4校正定量挑取同一样品（30～50）个疑似烟草疫霉菌菌落5mm×5mm的菌丝块，按照附录B鉴定疑似菌落，判别、统计阳性结果的

7、百分比，以此校正定量各土样中的烟草疫霉菌含量。4.3荧光定量PCR检测4.3.1烟草疫霉菌DNA提取按附录B提取烟草疫霉菌DNA，保存于-20℃冰箱中备用。4.3.2荧光定量PCR引物用于荧光定量PCR的特异性引物核苷酸序列为：——ParA1F:5’-CATTGAGTAGCCAGAGTCCGTC-3’；——ParA1R:5’-CCACCACGCAGCAAACTGCGGC-3c’。4.3.3实时荧光定量PCR检测4.3.3.1反应程序95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸15s，40个循环。PCR扩增结束后进行熔解曲线分析，以