国立成功大学生物化学研究所硕士论文.pdf

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1、國立成功大學生物化學研究所碩士論文人類細胞色素C參與活化Caspases的胺基酸之鑑定IdentificationoftheResiduesofHumanCytochromecInvolvedinActivatingCaspases研究生：蔡育宏指導教授：莊偉哲教授中華民國九十三年七月中文摘要計畫性細胞凋亡在不同的真核生物中的胚胎發育及組織的發展恆定扮演十分重要角色。在正常細胞受到刺激之後，有兩條不同的途徑會引發細胞凋亡。其一途徑是外在受體受到所引發的細胞凋亡，其次是與細胞中的粒腺體相關的內在途徑。這兩條訊息傳遞路徑都已經有相關的文獻研究。其中細胞色素C在於細胞受到

2、刺激之後會從粒腺體中釋放出來並且與Apaf-1蛋白結合成apoptosome進而引發內在路徑的細胞凋亡。細胞色素C是與Apaf-1的WD40區域產生蛋白交互作用活化procaspase9並進而產生caspase3的活化造成細胞凋亡。但是並無相關文獻指出關於細胞色素C是藉由哪些氨基酸與Apaf-1產生交互作用。因此，我們先使用牛的transducin綜合體(2TRC)與大腸桿菌Tolb蛋白(1CRZ)模擬出可能的Apaf-1的WD40(7)與WD40(6)區域之結構。藉由結構分析，我們假設人類細胞色素C之鹼性氨基酸Lysine可能與Apaf-1的WD40區域之酸性氨基

3、酸Asparticacid存在有重要的相互作用。因此，我們將人類細胞色素C上的K72,K73,K86,K87andK88突變成Ala，我們想要去驗證是否上述的Lys在與Apaf-1蛋白交互作用中扮演的角色。此外，有文獻研究指出Y67的硝化作用會造成細胞色素C的結構改變並影響其活化caspases的能力。因此，我們也對於Y67做了Y67W、Y67H、Y67A、Y67F之突變。我們將上述的人類細胞色素C之突變株表現在大腸桿菌中並使用K562細胞株細胞液去進行caspase3的活性分析。我們實驗中所使用的受質是螢光且具特異性的caspase3之受質Asp-Glu-Val-

4、Asp-7-amino-4-trifluoromethylcoumarin(DEVD-AFC)。分析人類細胞色素C造成caspases活化的氨基酸。我們在實驗結果中發現K86、K87、K88若突變成Ala則會使得活化Caspase3的能力降低。因此，我們猜測這些胺基酸可能是參與和Apaf-1作用的胺基酸並對於細胞凋亡有更進一步的瞭解。I英文摘要Apoptosisisanimportantformofprogrammedcelldeathrequiredfortheembryonicdevelopmentandtissuehomeostasisofmulticellu

5、larorganisms.Theextrinsicdeathreceptors-andintrinsicmitochrondria-dependentpathwaysfollowingtheapoptoticstimulusleadingtocaspasesactivationhavebeenwellcharacterized.Cytochromecreleasedfrommitochondriafunctionsasatriggerfortheformationofapoptosomeintheintrinsicapoptoticpathway.Theapopto

6、someisaheptamericcomplexcomprisedofapoptoticproteaseactivatingfactor-1(Apaf-1)andcytochromec.Theapoptosomebindsandactivatesprocaspase-9,resultinginactivationoffurthercaspases,suchascaspase-3,whichorchestratethefinalpackagingoftheapoptoticcell.Apaf-1isa130-kDaproteinconsistingofacaspase

7、recruitmentdomain(CARD),anarmdomain,andtwoWD-40repeats.ItwasshownthattheWD-40repeatsactasarecognitiondomainformitochondrialdamagethroughbindingtocytochromec,allowingApaf-1tooligomerizeandinteractwithprocaspase-9throughtheCARD-CARDinteraction.However,littleisknownabouthowhumancytochro