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《利用Gateway技术构建黄瓜HPL基因的RNA干扰载体_王聪颖.pdf》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、西北农业学报2013,22(2):152-158ActaAgriculturaeBoreali-occidentalisSinica利用Gateway技术构建黄瓜HPL基因的RNA干扰载体*?王聪颖,陈书霞,陈巧,郝丽宁,孟焕文,万旭花,申晓青,程智慧(西北农林科技大学园艺学院,农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室,陕西杨凌712100)摘要为探讨黄瓜脂氢过氧化物裂解酶基因(HPL)下调表达对黄瓜果实挥发性醛类物质合成的影响,设计1对特异引物,以黄瓜pDONR201-HPL质粒为模板,通过PCR扩增出323bp的片段。利用基于同源重
2、组原理的Gateway技术,将扩增的片段通过BP反应连接到入门载体pDONR201中。对扩增出的323bp的片段进行测序,测序结果显示该序列与原序列同源性为100%。在此基础上,通过LR反应将目的片段插入过表达的植物RNA干涉载体pHellsgate8,构建黄瓜HPL基因的RNAi表达载体pHellsgate8-HPLi,分别经限制性内切酶XhoⅠ、XbaⅠ酶切后获得323bp的片段,与预期结果一致。采用热击法将pHellsgate8-HPLi转化农杆菌GV3101,经菌液PCR扩增获得323bp的目的条带,表明RNAi表达载体pHellsga
3、te8-HPLi已成功转入农杆菌中。关键词黄瓜;HPL基因;RNAi干扰;克隆载体;表达载体;Gateway技术中图分类号Q943.2;S642.2文献标志码A文章编号1004-1389(2013)02-0152-07ConstructionofRNAiVectorsforHPLGeneofCucumberUsingGatewayTechnologyWANGCongying,CHENShuxia,CHENQiao,HAOLining,MENGHuanwen,WANXuhua,SHENXiaoqingandCHENGZhihui(Collegeo
4、fHorticulture,NorthwestA&FUniversity,KeyLaboratoryofHorticulturalPlantGermplasmResourcesUtilizationinNorthwestChina,YanglingShaanxi712100,China)AbstractInordertoprobetheeffectsofdown-regulatedexpressionofHPLgeneonbiosynthesisofvolatilealdehydesincucumber,a323bpinterferencefr
5、agmentwasobtainedbyPCRamplificationwiththespecificprimersandusingcucumberpDONR201-HPLplasmidasatemplate.ThefragmentwasintroducedintothepDONR201vectorviaBPreactionbasedonthehomologousrecombinationofGatewaytechnology.Itshowedthatthesequenceofinterferencefragmentwastotallyident
6、ifiedwiththatofHPLgene.ThentheinterferencefragmentwasintroducedintothedestinationvectorpHells-gate8viaLRreactiontoformRNAiexpressionvectorpHellsgate8-HPLi,whichwasdetectedbyre-strictionenzymeXhoⅠandXbaⅠanditwasconsistentwiththeexpectation.TheplasmidofpHells-gate8-HPLiwastran
7、sformedintoAgrobacteriumstrainGV3101byheatshockandthe323bpfrag-mentwasamplifiedusingthebacterialiquidPCR.KeywordsCucumber;HPLgene;RNAinterference;Cloningvector;Expressionvector;Gatewaytechnology*收稿日期:2012-05-17修回日期:2012-06-14基金项目:国家自然科学基金(31071813);高校基本科研业务费(QN2011088);西北农林科
8、技大学国际合作基金(A213021102);陕西省留学人员科技活动项目择优资助经费(A289021202)。第一作者:王聪颖,女,在读硕士,研究方向为
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