T∕CVMA 13-2018 H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光R∕T-PCR检测方法.pdf

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1、ICS11.220B41团体标准T/CVMA13—2018H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法Duplexreal-timeRT-PCRassayfordetectionofavianinfluenzaA(H7N9)virusCVMA中国兽医协会2018-10-24发布2018-10-24实施中国兽医协会发布T/CVMA13—2018前言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国兽医协会提出并归口。本标准起草单位：中国动物疫病预防控制中心本标准主要起草人：刘玉良、王传彬、宋晓晖、吴佳俊、杨林、孙明、陈西钊、乔明明、蒋菲、顾小雪、刘洋、

2、张硕、韩焘、赵柏林。CVMA中国兽医协会IT/CVMA13—2018H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了H7N9亚型禽流感病毒双重实时荧光RT-PCR检测试剂、仪器设备、实验操作步骤。本标准适用于禽组织、分泌物、排泄物和培养物中H7N9亚型禽流感病毒检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3试剂3.1RNA提取试剂RNA提取试剂详见附录A.1～A.4

3、，或选取商品化的病毒RNA提取试剂盒。3.25×RT-PCR缓冲液Trisbase15.14gKCl13.98g.MgCl26H2O1.53CVMAgDTT3.86中国兽医协会g加无核酸酶灭菌蒸馏水至400mL，调pH值至8.3（室温下），定容至500mL。过滤（0.22μm）除菌后置于2℃～8℃保存备用。3.3.10×PCR缓冲液的配制Trisbase6.06gKCl18.64gTritonX-1005.00mL加无核酸酶灭菌蒸馏水至400mL，用HCl调pH值至9.0（室温下），定容至500mL。高压灭菌冷却后置于2℃～8℃保存备用。3.3引物和探针1T/CVMA1

4、3—2018表1所用引物和探针名称序列（5＇-3＇）目的基因HA-7-FTGGTTTAGCTTCGGGGCRTCATHA-7-RACAAATAGTGCACYGCATGTTTCCHAHA-7-PFAM-CCATTGYAATGGGYCT-MGBNA-9-FACACTCAAACGGAACAATACACGNA-9-RGACCACCCAATGCATTCCACNANA-9-PHEX-AAGCTGGCCACTATC-MGB注1：将表中引物和探针均用无核酸酶灭菌蒸馏水稀释至10pmol/µL后使用。注2：引物序列中，R代表A或G碱基；Y代表C或T碱基3.4其他试剂TaqDNA聚合酶（5

5、U/µL）、AMV反转录酶（10U/µL）、RNA酶抑制剂（40U/µL）、无水乙醇、无核酸酶灭菌蒸馏水、生理盐水。4仪器设备分析天平、高速离心机、荧光PCR仪、组织研磨仪、-20℃冰箱、可调移液器。5操作步骤5.1样品采集CVMA样品采集中国兽医协会按照NY/T541进行。对于病死禽，取脑、肺、气管、喉头等组织；对于活禽，用棉拭子轻轻分别采集同一只禽的咽喉分泌物和少量泄殖腔粪便，放在含有保护液（50%甘油生理盐水）的同一离心管中，加盖，编号。5.2样品处理5.2.1组织样品每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，剪碎后取适量于研磨器中研磨，加入1.0mL生理盐水继

6、续研磨，待匀浆后转至灭菌离心管中，10,000×g离心2min，取上清液100µL于1.5mL灭菌离心管中。5.2.2分泌物和排泄物样品2T/CVMA13—2018将咽喉/泄殖腔棉拭子在振荡器上充分混合，捻动、挤压干后弃去拭子。10,000×g离心5min，吸取上清100µL于1.5mL灭菌离心管中。5.2.3培养物样品将培养物10,000×g离心5min，取上清100µL于1.5mL灭菌离心管中。5.3病毒RNA的提取5.3.1若选用附录A中所列试剂提取病毒RNA，则参照以下步骤进行操作：a)取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600µL，充分颠倒混匀，

7、室温静置3min～5min；b)将液体吸入吸附柱中，10,000×g离心30s；c)弃去收集管中液体，加入600µL洗涤液，10,000×g离心30s；d)重复上述步骤c）进行洗涤；e)弃去收集管中液体，10,000×g离心2min，以除去残留的洗涤液；f)将吸附柱移入新的1.5mL无菌离心管中，向柱中央加入洗脱液50µL，室温静置1min，10,000×g离心30s，离心管中液体为模板RNA。5.3.2若使用病毒RNA试剂盒提取病毒RNA，则按试剂盒说明书进行操作。5.4双重实时荧光RT-PCR扩增按照表2配制双重实时荧光RT-PCR扩