SNT 2695-2010 杀鲑气单胞菌的检验操作规程.pdf

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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２６９５—２０１０杀鲑气单胞菌的检验操作规程犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳犱犲狋犲犮狋犻狅狀犳狅狉犃犲狉狅犿狅狀犪狊狊犪犾犿狅狀犻犮犻犱犪２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２６９５—２０１０前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参照了美国渔业协会的《鱼类某些病原的检测和鉴定程序》（ＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓｆｏｒｔｈｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｅｒｔａｉｎＦｉｓｈＰａｔｈｏｇｅｎｓ）２００６

2、版中“疖疮病”（犉狌狉狌狀犮狌犾狅狊犻狊）一节。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张立怀、岳志芹、陈本龙、霍蕾、王建华、侯艳梅。Ⅰ犛犖／犜２６９５—２０１０杀鲑气单胞菌的检验操作规程１范围本标准规定了杀鲑气单胞菌的检验程序。本标准适用于进出口鱼苗、幼鱼和成鱼的检疫。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单

3、）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和试验方法３设备材料３．１材料３．１．１胰蛋白胨大豆蛋白胨琼脂（ＴＳＡ）：见附录Ａ．１实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２规定。３．１．２胰蛋白胨大豆蛋白胨血琼脂（ＴＳＡＢ）：见附录Ａ．２。３．１．３脑心浸液琼脂（ＢＨＩＡ）：见附录Ａ．３。３．１．４脑心浸液血琼脂平板（ＢＨＩＡＢ）见附录Ａ．４。３．１．５胰蛋白胨大豆蛋白胨肉汤（ＴＳＢ）：见附录Ａ．５。３．１．６考马斯亮蓝（ＣＢＢ）：分析纯。３．１．７微量生化反应管。３．１．８特异性抗血清。３．２设备３．２．１ＰＣＲ仪。３．２．２电泳仪。

4、３．２．３凝胶成像系统。３．２．４生化培养箱：－５℃～５０℃±１℃。３．２．５生物安全柜。３．２．６解剖器械。４样品的采集４．１无临床症状鱼，无菌采集其肾、肝、脾等。４．２对于体表有临床症状的鱼，可以采集其病灶深处的组织。１犛犖／犜２６９５—２０１０５细菌分离鉴定５．１样品的接种用拭子或接种环将无菌操作采集的组织在ＴＳＡ或ＢＨＩＡ上划线。推荐接种在相应血琼脂平板ＴＳＡＢ或ＢＨＩＡＢ上，于２０℃～２５℃培养４８ｈ。从金鱼、鲤鱼等病鱼的病灶部位分离时，用拭子或接种环取样接种到ＴＳＡＢ或ＢＨＩＡＢ上，于２０℃～２５℃培养４８ｈ。为便

5、于区分有毒力杀鲑气单胞菌的特异性菌落，可在培养基中加入０．１％的考马斯亮蓝（ＣＢＢ）。杀鲑气单胞细菌在含０．１％ＣＢＢ的ＴＳＡ或ＢＨＩＡ培养基上为深蓝、深紫色易碎的菌落，无毒力的菌株在该平板上为无色的菌落。５．２杀鲑气单胞菌的初步判定杀鲑气单胞菌菌体为革兰氏阴性短的（０．８μｍ～１．３μｍ）×（１．３μｍ～２．０μｍ）杆菌或球杆菌，两极浓染。无运动性，色素氧化酶绝大多数阳性。大多数产生弥散性棕色色素，发酵葡萄糖。在ＴＳＡＢ或ＢＨＩＡＢ上，菌落大多数溶血。符合上述特征的细菌可初步判定为杀鲑气单胞菌。５．３玻片凝集试验初步判定为杀鲑气

6、单胞菌的菌株，可以用杀鲑气单胞菌的抗血清进行玻片凝集试验。在干净的载玻片上，加一滴生理盐水和一滴抗血清，取一环细菌分别在生理盐水和抗血清中混匀，３ｍｉｎ内观察是否出现凝集。如果细菌在生理盐水中不凝集，在抗血清中凝集判定为杀鲑气单胞菌血清凝集阳性。如果细菌在生理盐水中凝集，则该菌为自凝菌株，不适用本试验鉴定。５．４细菌的犘犆犚鉴定５．４．１引物杀鲑气单胞菌ＶａｐＡ基因扩增的参考序列参见附录Ｂ。按照表１设计引物。表１犘犆犚引物序列靶基因引物序列号引物序列ＰＣＲ产物大小ＡＰ１５’ＧＧＣＴＧＡＴＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣ３’表面阵

7、列蛋白（１０８５１１０８）４２１ｂｐ基因（ＶａｐＡ）ＡＰ２５’ＣＡＧＡＧＴＧＡＡＡＴＣＴＡＣＣＡＧＣＧＧＴＧＣ３’（１５０５１４８２）５．４．２模板的制备对于分离的菌株，采用粗提的ＤＮＡ进行鉴定。将平板上的菌落取１接种环，加到２００μＬ的无菌去离子水中，摇匀后，在９５℃热处理５ｍｉｎ，置冰上冷却。１３０００犵离心３０ｓ，取上清液用于检测。用已知杀鲑气单胞菌菌株作阳性对照，用无菌去离子水作阴性对照。细菌ＤＮＡ的提取也可以采用等效试剂盒按说明书进行。５．４．３犇犖犃扩增采用２０μＬ反应体系：２犛犖／犜２６９５—２０１０１０×ＰＣ

8、Ｒ缓冲液２μＬＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬｄＮＴＰ混合物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ引物ＡＰ１（５μｍｏｌ／Ｌ）２μＬＡＰ２（５μｍｏｌ／Ｌ）２μＬ模板ＤＮＡ２μＬ犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ灭菌去离