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1、低氧模拟剂氯化钴对胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达的影响王清洪制作学号：092406102摘要S100A4基因是肿瘤侵袭转移相关的重要基因,该基因高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关。为探讨S100A4基因高表达的机制,用低氧模拟剂氯化钴处理胃癌细胞BGC823,RT-PCR、免疫组化、免疫荧光及Westernblotting方法分别检测BGC823细胞中S100A4mRNA及蛋白表达情况。结果显示,氯化钴处理胃癌BGC823细胞后,S100A4mRNA及蛋白表达明显增
2、加。提示低氧模拟剂氯化钴可促进胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达。低氧是实体肿瘤的共同特征,它是癌细胞快速增殖与血液供应相对滞后的结果。低氧引起肿瘤细胞生物学特性发生改变,如细胞侵袭、转移能力增加,并可能对放化疗产生耐受。低氧对细胞的影响主要通过调节基因表达而实现,因此研究低氧环境下转移相关基因的表达变化具有重要意义。S100A4蛋白是钙离子结合蛋白S100家族的成员之一,可降低肿瘤细胞间黏附能力、促进细胞外基质水解和重塑、增强肿瘤细胞运动能力、促进血管生成等,在肿瘤侵袭转移过程中发挥关键性
3、作用。现已证实S100A4高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关,但是目前关于S100A4表达调控的研究报道甚少。低氧是否可调节S100A4表达,尚未见报道。我们应用生物信息学软件在S100A4基因的调控区预测到低氧反应元件,推测微环境低氧可能上调S100A4基因表达。因此本实验观察了低氧模拟剂氯化钴处理对人胃癌细胞系BGC823中S100A4表达的影响,旨在研究微环境低氧对胃癌侵袭转移影响的机制,并探讨S100A4基因表达调控的新途径。材料和方法主要材料:BGC823细胞系;RP
4、MI1640培养基、胎牛血清;氯化钴;兔抗人S100A4多克隆抗体;b-actin抗体;总RNA提取试剂Trizol;反转录试剂盒及PCR扩增试剂盒;PCR引物。细胞培养和低氧诱导:取低分化的人胃腺癌细胞系BGC823,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液,另加青霉素(100U/mL)和链霉素(100mg/mL),37℃、5%CO2及饱和湿度的条件下培养。细胞生长至60%~70%融合度后,实验组加入含低氧模拟剂氯化钴(终浓度为100~500mmol/L)的培养基,对照组为正常培养基,继续培养2
5、4h后收集细胞。方法RT-PCR检测BGC823细胞中S100A4mRNA表达收集实验组和对照组细胞,应用Trizol提取总RNA,采用逆转录试剂盒将mRNA逆转录合成cDNA,取反转录产物2mL进行PCR反应。S100A4引物序列:上游:5′-GATGTGATGGTGTCCACCTT-3′;下游:5′-ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA-3′。扩增片段长度为277bp,复性温度为58℃;内参照b-actin引物序列:上游:5′-CCAGATCAtGTTTGAGACCT-3′;下游:5′-TT
6、GAAGGTAGTTTCGTGGAT-3′。扩增片段长度为480bp,复性温度为58℃。循环条件:95℃预变性5min,94℃变性30s,58℃复性30s,72℃延伸30s,30个循环,72℃延伸10min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳,LabWORKS凝胶图像分析系统分析扩增产物条带的光密度值,并通过S100A4光密度值与b-actin光密度值的比值反映S100A4mRNA表达量的高低。Westernblotting检测BGC823细胞中S100A4蛋白表达收集实验组和对照组细胞,立即置于冰
7、上,吸净培养基并以4℃预冷的PBS漂洗细胞1~2次,提取细胞总蛋白,以Bradford法作蛋白定量后,取50mg蛋白作SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(5%积层胶,10%分离胶),电转膜后,加入兔抗人S100A4多克隆抗体(1︰1000)和羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体,b-actin作为内参照,利用ECL显色试剂盒显色,应用图象分析仪测定条带光密度值,以S100A4光密度值与b-actin光密度值的比值来反映S100A4蛋白表达的高低。免疫细胞化学及免疫荧光检测S100A4蛋白在BGC823细胞中的表达将B
8、GC823细胞接种于玻片上,200mmol/L氯化钴处理24h后,取出玻片,4%甲醛固定。一抗为兔抗人S100A4多克隆抗体(1︰1000稀释),4℃孵育过夜。免疫组化采用北京中杉金桥生物技术有限公司SP检测试剂盒进行,DAB显色,光学显微镜下观察结果;免疫荧光二抗为FITC标记的鼠抗兔IgG(1︰2000稀释),室温孵育2h后荧光显微镜下观察结果。统计学分析采用SPSS统计软件进行检验,P<0.05具有统计学意义。结果与分析氯化钴对BGC823细胞S100A4mRN
