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1、494中国兽医学报2009年4月第29卷第4期ChinJVetSciApr.2009Vol.29No.4饲养层细胞的接种密度对分离培养胚胎干细胞的影响1,22,332,3122,3赵晶,董雅娟,柏学进,靳亚平,张廷龙,封纪武(1.西北农林科技大学农业部家畜内分泌与胚胎工程重点开放实验室,陕西杨凌712100;2.青岛农业大学动物胚胎工程中心,山东青岛266109;3.山东小黑牛集团公司,山东淄博255000)摘要:建立有效的昆明白小鼠胎儿成纤维细胞(Mouseembryonicfibroblast,MEF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(Embryonicstemcell,
2、ES细胞)的研究。(1)取怀孕14.5d昆明白小鼠胎儿分离成纤维细胞,利用体外培养体系分离传代,选取生长旺盛并且已纯化的P3代的MEF,经丝裂霉素处理后,用细胞计数板计算活细468胞数,分别按1×10、1×10、1×10/mL密度接种,制备饲养层,观察不同密度饲养层的生长状况。(2)取怀孕4d的昆明白小鼠囊胚,接种在不同密度饲养层上。观察不同密度饲养层上囊胚、ICM及ES细胞的克隆生长情况。结6果显示:囊胚在密度为1×10/mL的饲养层上,贴壁率和ICM孵出率分别为(97.0±3.606)%和(96.364±2.887)%,显著高于其他2组;密度为1×10/mL饲养层上的ES细胞克隆形成
3、率高于密度为1×10/mL(84差异极显著,P<0.01)和1×10/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率(差异显著,P<0.05);而1×10/mL饲养86层和1×10/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P>0.05)。结果表明:以1×10/mL密度接种的MEF作为饲养层,最适合用于分离培养昆明白小鼠ES细胞,有利于囊胚的发育,ICM的增殖,促进ES细胞的增殖,并起到抑制其分化的作用。关键词:昆明白小鼠;胎儿成纤维细胞;饲养层;胚胎干细胞中图分类号:Q81;S852.16文献标识码:A文章编号:100524545(2009)0420494208Effectofdensitieso
4、ffeederlayerforisolationandculturingofKunmingwhitemouseembryonicstemcells1,22,332,3122,3ZHAOJing,DONGYa2juan,BAIXue2jin,JINYa2ping,ZHANGTing2long,FENGJi2wu(1.KeyOpenLaboratoryofAnimalReproductiveEndocrinologyandEmbryoEngineeringoftheMinistryofAgriculture,Yangling,Shaanxi712100,China;2.TheCenterof
5、AnimalEm2bryoEngineeringQingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao,Shandong266109,China;3.Shan2dongXiaoheiniuGroupCorporation,Zibo,Shandong255000,China)Abstract:ToestablishfeederlayerculturesystemofKunmingmouseembryonicfibroblast(MEF)cellsforisola2tionandculturingofembryonicstem(ES)cellsinvitro.(1)MEF
6、wereisolatedfromthe14.5dfetusmouse.ByinvitroculturesystemofMEF,afterisolatedandsubcultured,usingGeneration3MEFwereselected.Aftertreated468withMitomycinC,livingcellwereinoculatedatconcentrationsof1×10,1×10and1×10/mLaftertheirnumbercountedasthefeederlayersofEScells.Thegrowthbehaviorofdifferentdensi
7、tyofMEFwasobserved.(2)Theblastulasof4dfromKunmingmousewerecollected,culturedonmediumwithdifferentdensityofMEF.Thegrowth6oftheblastulas,ICMandEScellswereobserved.TheblastulasculturedonMEFwithadensityof1×10/mLshowedthata
