乙型肝炎病毒cccDNA——检测方法与应用价值.ppt

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1、乙型肝炎病毒cccDNA——检测方法与应用价值第二军医大学长征医院缪晓辉2005.10一、几个相关问题简介什么是HBVcccDNA?即共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙型肝炎病毒的复制过程我们为什么要关注HBVcccDNA?cccDNA存在于细胞核内

2、，成为乙肝病毒的复制“池”目前尚没有可以进入细胞核内，并能够清除cccDNA的药物，这也是现有抗病毒药物治疗效果不佳和治疗后容易复发的原因之一肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏移植术后乙肝复发的来源还没有稳定、可靠、敏感的cccDNA检测试剂盒问世为什么没有cccDNA检测试剂盒问世?·研究和开发该检测技术的时间不长·检测技术上的难度较大·前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏模，不能满足临床检验的需求·现有技术灵敏度不高，检测低限104copy/ml左右·分研究机构和学者对

3、检测技术的特异性认识不足，存在缺陷·多种同源的乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、rcDNA、ssDNA、整合的HBVDNA），必须有效地分离cccDNA和其他类型的病毒DNA·如何进一步解决特异性的问题？·如何解决灵敏度不高的问题（细胞内cccDNA含量的较低），血清中含量？·如何简化检测步骤？建立cccDNA检测技术必须克服的难点cccDNArcDNA核酸一级结构完整的双链两条链均不完整核酸空间结构闭合环状，超螺旋松弛环状，非超螺旋是否与蛋白质结合不结合共价结合对某些核酸酶抗性强，不容易被

4、降解弱，容易被降解分离cccDNA和rcDNA的分子基础分离cccDNA和rcDNA的任何手段均基于上述差异二、HBVcccDNA检测技术1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法现有的几种cccDNA检测技术简介现有的几种cccDNA检测技术简介选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法设计一对特殊引物：跨双缺口引物正义引物P1：与负

5、链互补结合，位于正链缺口上游反义引物P2：与正链互补结合，位于负链缺口下游目的：rcDNA不被扩增1.选择性PCR选择性PCR：rcDNA不被扩增选择性PCR：cccDNA能被扩增PCR产物自身退火（selfannealing）“选择性”PCR：并非万无一失国内外许多研究者忽略了这个问题，rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠HepatologyResearch2003;15:234-243（PBMC）WorldJGastroenterol2004;10(1):82-85(血清)

6、Kock等：反应管中rcDNA含量不能超过105copyHepatology1996;23:405-413我们的经验：血清HBVrcDNA超过108copy/ml，进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性“选择性”PCR：并非万无一失与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA的负链互补。选择性实时荧光定量PCR检测cccDNArcDNA不能被扩增无荧光信号EcoRI5‘+P1P23200(1)5‘3‘15903‘1820P118201590+3200（1）E

7、coRIP2cccDNA能被扩增检测到荧光信号选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的原理标准曲线方程YCt=42.0827-3.5554logXcopy相关指数：R2=0.995灵敏度至少可以达到103copy/ml我们的结果：选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA·同样存在PCR产物自身退火引起的rcDNA非特异性扩增的问题·由于灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普通PCR更高缺陷：选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA质

8、粒标准品107copy/ml3.5×108copy/ml携带者血清质粒标准品105copy/ml105~107copy/ml携带者血清选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA解决方案特异性抽提分离cccDNA与其它形式的病毒DNA采用沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法酶切纯化cccDNA采用绿豆核酸酶或ATP依赖的plasmid-safeDNA酶选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PC