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时间:2020-03-16
《流式细胞检测细胞晚期凋亡原理与图解.doc》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、流式检测细胞周期与晚期凋亡样品处理流程原理:在生物细胞中,DNA含量是恒定的参量,DNA含量随着细胞增殖周期各时期不同而发生变化,G0期细胞被认为是不参与细胞周期循环的一群细胞,即为静止细胞,其细胞为恒定的二倍体DNA含量,G1期细胞具有增殖活性,参与细胞周期循环,G1和G0期细胞DNA含量相同,均为二倍体,当细胞进入S期后,DNA含量逐渐增加,从二倍体到四倍体,一直到细胞DNA倍增结束,进入G2期,最终进入M期。荧光染料和细胞DNA分子可特异性结合,具有一定的量效关系:DNA含量与荧光染料的结合成正比,荧光脉冲与直方图通道值成正比根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
2、这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等,其中细胞核的改变最具特征性。由于核的改变造成各种荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变,细胞凋亡时,核酸内切酶激活,导致DNA广泛断裂,这是细胞凋亡的特征性表现,由于细胞膜的通透性增加和固定剂的影响,使DNA不能完全封闭在细胞中,凋亡细胞DNA含量减少,DNA直方图上显示在G1期前面出现一个DNA含量减少的亚二倍体峰,又称凋亡峰!样品处理:1.胰蛋白酶消化法收集处理好的细胞,做成单细胞悬液2.1000r/min离心5min,收集沉淀。3.沉淀用PBS洗2次,1000r/min离心5min,收集沉淀。4.细胞沉淀用4℃
3、预冷的70%的冰乙醇(预冷的70%酒精)1ml重悬,4℃过夜。即可送检。5.3000r/min离心1min离心去除固定液,用PBS洗2次,加入300ul-500ulPI与RNA酶混合液(PI50ug/ml,RNA酶10ug/ml)6.将细胞沉淀弹散,放入37℃温箱中,孵育30min7.上机检测8.结果判断:在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上,凋亡细胞与正常细胞相比,前散射光降低,而侧散射光可高可低,与细胞的类型有关;在分析PI荧光的直方图时,先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片,在PI荧光的直方图上,凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧
4、光强度为1.0,则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45,可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准,两者分别为0.35和0.7,可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。图解:
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