冻干黄热活疫苗制造及检定规程.doc

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1、冻干黄热活疫苗制造及检定规程本品系用减毒的黄热病毒17D株接种鸡胚，经研磨、离心，取上清液冻干制成。专供进入或经过黄热流行地区的人员预防黄热之用。1毒种1.1毒种來源减毒黄热病毒17D株。1.2毒种检定1.2.1无菌试验按《生物制品无菌试验规程》进行。1.2.2纯毒试验用已知黄热病毒免疫血清做中和试验，证明其为黄热病毒。1.2.3猴体安全及效力试验取冻干黄热17D毒种，加无菌生理盐水恢复其原液量，接种无黄热病毒中和抗体之恒河猴10只，每只脑内注射0.25ml(50000个小白鼠LDQo注射后第2、4、6日各采血1次，分离血清，分别做10倍系

2、列稀释。以原血清及10’〜10：」各稀释度的血清分别脑内注射体重10〜12g小白鼠6只，每只0.03ml,观察21天，检查病毒量，LD50均不得超过Log2（4天以内死亡的小白鼠不计算在内）。猴子经注射后2〜4周，再采血1次，分离血清，做中和抗体测定。10只猴中至少要有9只血清表现阳性中和反应。在1个月的观察期中，发现脑炎症状或因而死亡者不得超过1只猴。1.3毒种保存原毒种和生产毒种批均应冻干后真空封口，保存于-70°C以下。1.4毒种传代和生产毒种的制备取毒种3支，启开安甑后立即以稀释液（不应含有任何人体蛋白和外源血清或抗体）溶化。待全部

3、溶化后接种于7日龄鸡胚卵黄囊，每胚0.2nd。分2组进行，每组不得少于10胚，置37.5〜38°C培育。70〜80小时按组收取活存鸡胚，每组不得少于4胚。去眼后分组混合研磨，加稀释液做成悬液，经2000r/min离心10分钟，吸取上清液，在鸡胚中传代，并抽样按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验。按同法连续传递2代，传代时可不等无菌试验结果，第3代毒种的鸡胚收获后，吸取容器内液体做无菌试验（方法同上），并将鸡胚冻存于-40°C以下。将无菌试验阴性之鸡胚取出融化。按每胚加入lml稀释液研磨，经2000r/min离心10分钟，吸取上清液，加入稀

4、释液稀释5倍后置冰浴中待用。同时做毒力滴定。此代即为生产毒种。2疫苗制造1.1接种鸡胚用7日龄鸡胚，每胚接种适当稀释度毒种液0.1〜0.2ml于卵黄囊，接种后滴蜡封口。2.2培育接种后37.5〜38°C培育，70〜80小时开始收获。2.3收获收获时剔去死胚，分组收获活存鸡胚，去眼，装入大管中，逐管吸取管内液体做无菌试验，在操作过程中盛鸡胚之大管应置冰浴中保冷，收获完毕置-40°C冻存。2.4研磨、离心1.4.1研磨剔除洒菌鸡胚，将冰冻鸡胚大管置冷水中融化，倒入研磨桶内，按每胚lml加入灭菌双蒸水，用电动研磨机8000r/min研磨3分钟。2

5、.4.2离心，收取上清液将研磨后的鸡胚悬液以减压虹吸法分装于500ml瓶中，塞以胶塞,用2000r/min离心30分钟。离心应在2〜5°C进行。收取上清液，每批装一个球瓶，换以胶塞，保存在冰浴中。1.5半成品检定2.5.1无菌试验按《生物制品无菌试验规程》进行2.5.2冻干前病毒滴定吸取球瓶中样品，作10倍系列稀释。取10T〜10-6之病毒液，每个稀释度用体重10〜12g小白鼠6只，每只脑内注射0.03ml,接种部位忌用碘酒消毒，观察21天，计算LD50。2.6分装疫苗保存在冰浴中进行分装，每安甑分装量为0.5ml（10人份）。分装后将盛安

6、甑之金属盒放入-40—50°C预冻2小时。2.7冻干全部冻干过程为15〜17小时，最后5小时升温20〜25°C,最高不得超过25°C。冻干后安甑真空封口。3成品检定1.1物理检查外观为略带粉红色的疏松体，水分不应超过3%(g/g),加入稀释液应迅速溶解。1.2无菌试验按《生物制品无菌试验规程》进行。3.3猴体安全及效力试验方法及要求见1.2.3项，如生产毒种做过猴体安全及效力试验则疫苗可免做。3.4豚鼠安全试验按原分装量加入生理盐水溶解疫苗，用体重300~500g豚鼠2只，试验前2〜3天每天量体温、称体重。然后每只腹腔注射0.5ml,观察7

7、天，每天量体温，应无病症发生。如2只豚鼠均有显著反应(体温超过40°C,体重减轻)或死亡，则该批疫苗应废弃；如有1只豚鼠有症症发生，可再用3只豚鼠重试，重试中如有2只以上豚鼠发病时，判为不合格，制品应废弃；如有1只发病，则再重试，仍有发病则判为不合格，制品应废弃。1.5病毒滴定同半成品检定。每只小白鼠脑内注射0.03mlo病毒滴度应23.66LogLD50o3.6稳定性试验由每批疫苗成品取3安甑，置37°C2周，滴度下降不应超过lLogo3.7鉴别试验每亚批成品应按1.2.2项进行鉴别试验。3.8稀释液氯化钠注射液，其质量应符合《中国药典》

8、规定。4保存与效期应保存于-20°C,自干燥之日起效期为1年半，如保存于2〜8°C,效期为6个月。