《蓝白斑筛选法》PPT课件.ppt

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1、实验十五重组子的筛选技术－－蓝白斑筛选法【实验目的】学习蓝白斑法筛选重组菌落的原理及具体的实验操作过程。【实验材料】移液器及吸咀培养皿接种环1.5mL离心管恒温培养箱水浴锅LB液体培养基蛋白胨8g氯化钠7g酵母5g定容至1000mL，用NaOH调pH至7.5~7.6，可置-20℃保存，高压灭菌LB固体培养基液体培养基中加入1.5%的琼脂，15磅30分钟高压灭菌后使用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖)X-gal溶于N,N’-二甲基甲酰胺中配20mg/mL原夜，-20℃避光保存IPTG(异丙基--D-半乳糖苷)0.2g/mL分装，贮存于-20

2、℃氨苄青霉素(Ampicillin)1gAmpicillin溶于5mL灭菌水中，配成母液，保存于-20℃转化菌【实验原理】β-半乳糖苷酶是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶，最常用的β-半乳糖苷酶基因来自大肠杆菌lac操纵子，它们使载体中带有大肠杆菌lac操纵子的调节序列和编码β-半乳糖苷酶N末端146个氨基酸的序列。用异丙基--D-半乳糖苷(IPTG)可诱导这个末端片段的合成，合成的片段能与宿主编码的β-半乳糖苷酶缺陷型进行互补，恢复该酶的活性，这一过程称为α-互补。由于克隆用载体pGEM-TEasyVector带有lacZ的调节序列和β-半乳糖苷酶的部分编码

3、序列，可以与缺陷型宿主DH5α在诱导物IPTG存在下，形成α-互补，宿主菌在含色素底物X-gal的培养基平板上形成蓝斑；在有外源DNA片段插入到载体多克隆位点时，就使载体编码β-半乳糖苷酶的部分序列失活，带有重组质粒的宿主菌产生白斑。为提高筛选的准确性，实验中采取蓝白斑筛选法。【实验原理】X-gal和IPTG的作用IPTG可诱导缺陷型大肠杆菌DH5α表达出半乳糖苷酶，该酶可分解添加于培养基中无色的X-gal成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯-靛蓝，使菌落呈现出蓝色反应；在T质粒载体lacZα序列中，含有一系列不同限制酶的单一识别位点，其中任何一个位点插入了外源克隆D

4、NA片段，都会阻断半乳糖苷酶的读码结构，使其编码的α肽失去活性，结果产生出白色的菌落。因此，根据这种半乳糖苷酶的显色反应，便可检测出含有外源DNA插入序列的重组克隆。【实验步骤】1、平板的准备在40uLX-gal中加入4uLIPTG，充分混合，在无菌条件下涂布于含Amp(浓度为50ug/mL)的LB平板上，将平板置于37℃恒温箱中2~3hr，以使培养基充分吸收色素底物X-gal；2、涂板将转化菌在无菌条件下涂布于含抗生素和X-gal、IPTG的平板上，正面朝上放置30分钟，待菌液完全被吸收后倒置平板，37℃培养12~18hr；3、观察实验结果蓝白斑筛选重组菌落添加有氨

5、苄青霉素、X-gal和IPTG的固体培养基连接产物涂布37℃培养12~16h挑取白色菌落......….....….....….….....….....….液体培养