厌氧菌的培养方法.ppt

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1、厌氧菌的培养方法祁红兵物理方法包括遮断空气法、煮沸法、真空法、空气置换法、气体喷射法或转管法等化学方法包括焦性没食子酸法、铁丝绒法、保险粉法等生物学方法包括与需氧菌共生好氧法、燕麦发芽法等混合法包括厌氧罐（袋）法、厌氧手套箱法或厌氧室法、空气置换铁丝绒法、空气置换钯粒法等。1液体培养基的厌氧培养法培养基煮沸：驱气后置流水中急速冷却添加还原剂：0.03～0.05％L-盐酸半胱氨酸0.01～0.02％硫乙醇钠0.5～1％葡萄糖0.1％抗坏血酸其它还原剂添加琼脂2固体培养基的厌氧培养法厌氧罐法简易厌氧罐和厌氧袋法钢丝绒法焦性没食子酸法抽气换气厌氧培养法生物好氧厌氧培养法转管技

2、术和气体喷射培养法厌氧手套箱法（又称厌氧室法）2.1Gas-pak法原理气体发生袋：柠檬酸和碳酸氢钠＋H2OCO2硼氢化钠＋H2OH2触媒：钯粒H2O厌氧罐中的O2厌氧指示剂11111厌氧指示剂亚甲基兰指示剂卢卡斯固体厌氧指示剂布鲁氏指示剂亚甲基兰指示剂6％葡萄糖水溶液20.1N氢氧化钠水溶液0.10.05％亚甲基兰水溶液0.2厌氧无色残存有氧气蓝色卢卡斯固体厌氧指示剂2％硼砂溶液5毫升9％硫乙醇酸1毫升酚红溶液0.1～0.2毫升0.02％美兰溶液10毫升琼脂1％厌氧无色残存有氧气蓝色布鲁氏指示剂60％羟甲基氨基甲酯14％葡萄糖10.02％美蓝1厌氧无色残存有氧气蓝色G

3、as-Pak罐的使用操作程序平皿培养基装入平皿架中置厌氧罐内；打开内盖居中金属网袋，装入触媒钯粒；打开锡箔纸袋，取出厌氧指示剂片；剪开气体发生袋一角，注入10毫升水，迅速紧闭罐盖，置培养箱中培养。约经5～10分钟后，放入厌氧指示剂片。2.2.1简易厌氧罐干燥器容内径（厘米）容器1容器2容器3容积（毫升）硼氢钠氯化钴0.2克柠檬酸0.6克15cm（约2150毫升）或和0.6克钯粒1.5克碳酸氢钠0.7克18cm（约3500毫升）硼氢钠氯化钴0.33克柠檬酸1克或和1克钯粒2克碳酸氢钠1.15克2.2.2厌氧袋法聚碳酸酯（复合塑料膜）制厌氧袋产气袋厌氧指示剂触媒2.2.3保

4、险粉的厌氧罐培养法二亚硫酸钠（Na2S2O4）碳酸氢钠无水硫酸钠不用触媒2.3钢丝绒法酸性硫酸铜溶液钢(铁)丝绒铜和铁的络合物O2厌氧指示剂酸性硫酸铜溶液：将自来水1升加硫酸铜60g，吐温-8020ml，加热溶解后，又加入2N的硫酸90ml，最后加水至6升；方法：取5～6g钢丝绒/L，于1～1.5升酸性硫酸铜溶液浸泡30～60s，钢丝绒变成红铜色，挤净液体置铝质或玻璃容器中，放入厌氧罐内。随后将厌氧指示剂放入，密封厌氧罐，1～4h后可达厌氧状态2.4焦性没食子酸法焦性末食子酸粉末，NaHCO3或NaOH溶液无菌玻片已接种细菌的平板倒扣在上面融化的白蜡封边2.5抽气换气厌

5、氧培养法玻璃干燥罐混合气钢瓶:10％二氧化碳、10％的氢气、80％的氮气三通阀触媒:钯粒/浸泡钢丝绒/氯化钴厌氧指示剂1：厌氧培养罐2：混合气体（CO2：H2：N2=1：1：8）钢瓶3：压力表4：三通阀5：缓冲瓶6：真空泵2.6生物好氧厌氧培养法疱肉培养基:牛肉渣0.5g牛肉浸液7ml液面上加盖3～4mm厚的融化凡士林，灭菌。生物好氧厌氧培养方法2.7转管技术和气体喷射培养法360℃钢瓶进气铜柱除氧气体（亮黄色）微量O2H2源CuO（黑色）接种或移植2.8厌氧手套箱法又称厌氧室法3厌氧培养方法的选择亨格特的预还原灭菌厌氧培养基的转管技术、气体喷射培养法厌氧手套箱培养法用

6、于要求严格的厌氧培养法的微生态学（正常菌群）的研究工作厌氧罐(袋)法结合其它厌氧培养方法不适用于对氧极其敏感的厌氧菌。但是在临床细菌的检验工作中，可以充分使用此法分离感染症中的厌氧病原菌。4厌氧菌的保存4.1继代保存：以GAM半固体流动培养基和TEP半固体培养基作传代培养保存。用毛细吸管吸菌进行继代培养，使用白金接种环移菌接种，可以避免有的菌在操作中接触空气或氧化物而死亡。数周作一次继代培养。新分离的的菌种，在几个月内，每3～4星期传代一次。被保存的菌种，放室温下暗处。最好是不同菌用不同培养基保存。4.2冷冻保存：20％脱脂牛奶0.5ml分注在带螺旋塞的玻璃瓶中，经11

7、0℃、15分钟高压灭菌，冷却后，先用毛细吸管取半固体高层培养基24～48h生长茂盛部位的厌氧菌液0.5ml，加入玻璃瓶中，直接置于－80℃冰库中保存。厌氧菌较理想的保存方法是液氮保存法。将108以上浓菌液置脱纤维羊血、脱纤维兔血或羊血牛奶各半的分散剂中，先在干冰中预冻，然后连容器一起放入液氮罐中。谢谢