Toll样受体信号影响精子运动的机制.pdf

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1、朱星星：Toll样受体信号影响精子运动的机制Toll样受体信号影响精子运动的机制MechanismsofToll—likereceptorinaffectingmousespermmotility研究生：朱星星导师：龚卫娟教授，周洪教授扬州大学二零一四年五月扬州大学硕士学位毕业论文2Toll样受体信号影响精子运动的机制YIllll2Ulll6IH3Ill2113I

2、0114II中文摘要生殖道感染是引起男性不育及女性不孕的最重要原因之一，而感染能启动固有免疫应答。Toll样受体(TLR)作为固有免疫系统的重要分子，在固有免疫系统抵抗外界干

3、扰方面发挥着重要作用。近年的研究发现TLR表达于作为生殖细胞的精子中，而精子运动被认为是成功受孕的关键。为了探索TLR信号对精子生物学功能的影响，我们首先观察了不同TLR激动剂对精子运动的影响，发现TLR激动剂能够显著抑制精子运动。本课题拟深入研究TLR信号影响精子运动的具体信号通路，并在此基础上进一步探究TLR信号通过影响精子的何种生物学过程最终导致了精子运动减慢。研究内容分为3个部分：1．不同种类的TLR激动剂对精子生物学性能的影响目的：观察不同病原组分的TLR激动剂对小鼠精子运动的影响，并初步探讨TLR激动剂抑制精子运动的可能原因

4、。方法：采用逆转录PCR的方法分析不同TLR在精子中的表达。利用计算机辅助精子分析(CASA)的方法观察不同TLR激动剂与小鼠精子孵育6h后的精子运动情况以及TLR激动剂处理不同时间对正常人精子运动的影响。利用流式细胞术的方法观察TLR激动剂处理6h后的小鼠精子凋亡情况。结果：除了TLR3表达量极低之外，其它的TLR在精子中均有表达。在TLR激动剂处理小鼠精子6h后，除了TLR3所对应的激动剂poly(I：C)对精子运动没有影响，其他TLR激动剂均能不同程度地抑制精子运动。另外，TLR激动剂抑制精子运动具有时间依赖性，Zymosan与L

5、PS均只能在处理6h后才有效抑制精子运动，而R848在作用精子2h后即有抑制效应。与对照组相比，TLR激动剂在6h之内不能有效地促进精子凋亡的发生。结论：TLR激动剂能够有效抑制精子运动并且该效应并不由TLR激动剂促进精子凋亡引起的。2．TLR信号影晌精子运动的通路研究目的：探索TLR信号影响精子运动的确切信号通路方法：利用MyDS8敲除小鼠研究TLR激动剂对该种小鼠精子运动的影响。使用LPS处理小鼠精子2h，4h，6h，提取蛋白，通过Western-blotting观察小鼠精子IRAK，P13K，GSK3a，AKT,GSK313，ER

6、K,p65等分子磷酸化水平的变化，同时使用IRAK，P13K，朱星星：Toll样受体信号影响精子运动的机制3MEK／ERK．NF—r．B等分子的抑制剂处理小鼠精子半小时后再给予TLR激动剂刺激，CASA观察信号通路被抑制精子运动的改变。使用P13K抑制剂处理小鼠精子，Western．Blotting观察AKT及GSK3a磷酸化水平的变化。结果：TLR激动剂对MyD88敲除小鼠的精子运动无影响。TLR激动剂处理小鼠精子后可观察到IRAK，P13K，GSK3a等分子磷酸化水平随处理时间的延长而上升，而AKT,GSK3p，ERK，p65等分子

7、的磷酸化水平无明显变化。IRAK或P13K通路被抑制后TLR激动剂不再能够显著抑制精子运动，而ME列ERK，NF．r．B通路被抑制后TLR激动剂依然能显著抑制精子运动。P13K抑制剂处理小鼠精子后，AKT的磷酸化水平没有显著改变而GSK3a的磷酸化水平受到了显著地抑制。结论：TLR信号以MyD88／IRAK4／P13K及GSK3a依赖而非AKT依赖的信号通路途径抑制精子运动。3．TLR信号影响精子的生物学过程研究目的：探讨TUt信号通过影响精子的何种生物学过程最终抑制了精子运动，并将深入分析TLR信号通路在影响该生物学过程中的作用。方法

8、：利用荧光素酶反应的方法检测TLR激动剂处理6h后小鼠精子ATP水平的变化，进而使用基因敲除小鼠分析TLR激动剂引起的精子ATP水平的变化是否依赖MyD88及P13K。采用FlF。ATPaseELISA检测试剂盒检测TLR激动剂处理6h后正常人精子FlF。ATPase的活性变化。利用JC．1线粒体膜电位检测试剂盒通过流式细胞术检测TLR激动剂处理不同时间对小鼠精子膜电位的影响，并利用Western．blotting分析相关信号通路分子在TLR激动剂处理后转移到线粒体的情况。结果：与对照组相比，TLR激动剂处理后显著降低了小鼠精子ATP水

9、平，并且TLR激动剂不能引起MyD880及pik3cd乒小鼠精子ATP水平的变化。TLR激动剂处理6h后能够引起正常人精子FlF。ATPase活性的显著上升，并以时间依赖的方式降低小鼠精子线粒体膜电位。最后