细胞悬浮培养.doc

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1、一、实验目的及意义植物悬浮培养的细胞具有生长迅速、代谢均匀一致的特点，同时生长环境易于控制。由于培养的细胞对外界的乞种反应比较灵敏，植物悬浮培养细胞已成为代谢、生理生化、分了生物学研究的理想材料，同时还可用于突变体筛选、次生代谢产物的生产等领域。通过学习，使学生了解和掌握植物细胞悬浮培养的原理和操作技术。烟草(NicotianatubacumLinn.)为茄科经济作物，同时也是植物分了生理生化研究一种重要的模式植物。川参(SalviamiltiorrhizaBunge)为唇形科药用植物，建立悬浮体系，对构建分离纯化其药用物质体系具有重要意义。二、实验原

2、理植物细胞悬浮培养(plantcellsuspensionculture)是将游离的单细胞和小细胞团在不断震荡的液体培养基屮进行培养。用于悬浮培养的细胞和细胞团既可来自培养的愈伤组织，也可以通过物理或化学方法从植物的组织或器官屮获得o木实验所用的悬浮培养细胞来6疏松的愈伤组织。植物细胞悬浮培养系统要求：①细胞培养物分散性好，细胞团较小；②细胞形状和细胞团大小均匀一致；③细胞生长迅速。所采用的液体振荡培养具有以下重要作用：①振荡可以对培养液屮的细胞团施加一种缓和的流变力，使它们破碎成小细胞团和单细胞；②振荡有利于细胞在培养基屮均匀分布，有利于培养基与细胞

3、间的物质交换；③培养液的流动有利于培养基和容器内的空气通过气液界面Z间进行气体交换，保证细胞呼吸所需的氧气，使细胞能迅速生长，同时也有利于二氧化碳的扌非除。三、实验仪器与药品超净工作台，恒温振荡器(摇床)，高压灭菌锅，培养室(培养箱)，封口膜，油性标记笔，无菌蒸馆水四、实验材料烟草愈伤组织五、操作步骤与方法1.配制培养基成分母液倍数或浓度(mg/ml)配制1.0L培养基所需量配制培养基所需母液杲(ml)或直接称量量(g)大量元素20倍液50ml50ml微量元素200倍液5ml5ml铁盐200倍液5ml5ml有机物质200倍液5ml5m1蔗糖30g30g

4、NAA1.Omg/mlKTl.Omg/ml6-BA1.Omg/ml2,4-D1.Omg/ml1.0ml1.0ml琼脂pH值5.8将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌示冷却。2.培养前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20〜30min,关闭紫外灯，开启通风开关。洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。进入超净T作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。3.培养开始时，将银了在洒精屮浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。用银了夹取约2g疏松易碎的愈伤组织接种至培养基屮

5、，并将其组织块捣碎。然麻将一部分三角瓶封口后放在摇床上进行振荡培养，培养条件为25°C、120r/min.黑暗。每隔7天观察一次。将另一部分三角瓶在室温黑暗条件下静置培养，每隔7天观察一次。六、实验结果日期现象分析备注2011.4.15愈伤组织在液体培养基中呈分散悬浮状态如图V2011.4.22静置的细胞悬浮液屮少呈细胞成团状聚集摇床上的细胞悬浮液屮细胞数量明显增加，液体较浑浊摇床上的悬浮液由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来，接触培养基的面积更大，吸收养分更多，分裂速度更快静置的悬浮液由于细胞分裂后相互聚集，接触培养基的面

6、如图VI2011.4.29静置的细胞悬浮液细胞团体积部分增人摇床上的悬浮液屮细胞数最再次增加，如图VI液体很浑浊积均不如摇床上的悬浮液细胞，所以分裂速率较慢