悬浮细胞培养技术讲义.doc

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1、细胞培养技术相关知识简介一.培养细胞生长过程：潜伏期→指数增生期→停滞期1.1潜伏期(latentphase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩,胞体呈圆球形.然后细胞贴附于载体表面,称贴壁,悬浮期结束.细胞贴壁速度与细胞种类,培养基成分,载体的理化性质等密切相关。一般情况下，原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24小时或更多,而传代细胞系贴壁速度快,通常10-30分钟即可贴壁。细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期.原代培养细胞潜伏期长，约24-96小时或更长,

2、连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅需6-24小时。1.2指数增生期(logarithmicgrowthphase)这是细胞增殖最旺盛的阶段，分裂相细胞增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志。通常以细胞分裂相指数（Mitoticindex,MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%，原代细胞分裂指数较低，而连续细胞和肿瘤细胞分裂相指数可高达3％－5％。指数增生期的细胞活力最好时期，是进行各种实验最佳时期，也是冻存细胞的最好时机。在

3、接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3－5天后，随着细胞数量不断增多、生长空间减少，最后细胞相互接触汇合成片。正常细胞相互接触后能抑制细胞运动，这种现象称接触抑制现象(contactinhibition)。而恶性肿瘤细胞无接触抑制现象，能继续移动和增殖，导致细胞向三维空间扩展，使细胞发生堆积（piledup）。细胞接触汇合成片后，虽然发生接触抑制，但只要营养充分，细胞仍能进行增殖分裂，因此细胞数仍然在增多。但是，当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养枯竭和代谢产物的影响，导

4、致细胞分裂停止，这种现象称密度抑制现象（DensityInhibition）。1.3停滞期(Stagnatephase)细胞数量达到饱和密度后，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停止期。此时细胞数持平，故也称平台期（Plateauphase）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动。如不进行分离传代，细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH下降等因素中毒，出现形态改变，贴壁细胞会脱落，严重的会发生死亡。为了维持细胞的存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养

5、。9二.细胞传代方法根据细胞生长特点，传代方法有3种2.1悬浮生长细胞传代多采用离心法传代。1000转/分,20-30秒后去上清。沉淀细胞加新培养液后再混匀传代。亦有直接传代法，即悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2-1/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。本实验采用此法。2.2半悬浮生长细胞传代此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁上脱落下来，进行传代。直接吹打对此类细胞有损伤，亦可采用酶消化法传代。2.3贴壁生长细胞传代必须采用酶消化法。常用的消化液有0.05

6、%~0.25%的胰蛋白酶液，0.1%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA（1:2~1:4）的混合消化液，等等三.培养细胞常规检查细胞接种或传代后，要定时对细胞做常规检查，如观察培养液pH（颜色变化）、清亮度（是否污染）和细胞生长状态等，随时掌握细胞动态变化，发现异常情况及时对症处理。1.营养液pH值：新鲜的RPMI-1640培养液呈橙红色（pH7.2左右），适合多数细胞生长。细胞生长旺盛、代谢产生酸性物质积累增多，营养液酸化变黄，pH值下降；若培养瓶瓶塞刷洗不洁，残留碱性物质，致营养液pH值升高，颜色变紫红色。

7、两种变化均对细胞生长不利。采用5%CO2与95%空气混合气体，37℃条件培养细胞，可使培养液pH值在一定时间内保持在pH7.2左右。更换营养液的时间可依靠营养物消耗而定，一般情况下，每周换液两次，每次换半量或1/3量。2.微生物污染及排除污染包括微生物污染、细菌污染、霉菌污染、支原体污染、病毒污染（参阅有关参考书）其排除，良好的无菌操作技术是控制污染的基础。污染时首先找出污染原因。针对不同原因有相应的处理方法（在此不详述）。但目前任何处理的方法均对细胞有损伤，所以还应着重污染的预防。3.细胞交叉污染及排除由

8、于在细胞培养操作过程中，多种细胞培养同时进行时，器材和培养用液混杂易导致细胞交叉污染。这种污染是细胞形态和生物学特性发生变化，某些变化不易察觉。导致细胞不纯。9防止交叉污染的措施主要有：器材做好专门标记，培养液公用时，吸管使用分开！4.化学物质污染及排除主要为残存洗涤剂、细胞残余、解体的微生物等。鼓细胞实验所用全部实验器材都要严格清洗。5.健康细胞与衰老细胞光镜下生长状态良好的细胞均质、明亮、透明度大、折光性强，