植物组织培养实验室的构建与操作技术.ppt

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1、主要内容组织培养实验仪器设备及使用方法无菌操作技术培养基的制备方法和步骤外植体的灭菌方法褐变和玻璃化原因及应对措施2植物细胞组织培养的基本技术第一节　植物组织培养实验室及主要设备实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。实验室的大小应取决于工作的目的和规模按组织培养流程来设计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱利用一定的设备、器材和特殊的实验室结构设计，达到严格无菌的条件一、实验室设计与设备基本设备1.准备室：根据实验操作的性质，进行适当的分区清洗区培养基配制区试剂存放区灭菌区准备室主要仪器设备：工作台药品柜冰箱普通冰箱、低温冰箱等。主要用于贮存母液、

2、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。天平感量0.001g的分析天平、感量0.0001g的电子天平（用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品）、感量为0.1g的托盘天平（用于称取用量较大的糖和琼脂等）放置在水平、干燥、不受震动的操作台上(5)恒温水浴锅(6)蒸馏水发生器蒸馏水用于配制母液或培养基（普通实验可以用自来水代替蒸馏水）(7)电炉(8)高压灭菌锅进行培养基、水和器械用具的灭菌(9)酸度计测定培养基及酶制剂的pH值（普通实验可使用pH试纸）(10)烘箱干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重(11)摇床振荡培养(12)离心机分离培养基中的细胞

3、以及解离细胞壁后的原生质体PHS-802中文台式酸度计通用型或经济型酸度计全温型恒温培养摇床多振幅高速轨道摇床不锈钢蒸馏水器（单蒸水）２、缓冲室（注意门的朝向）工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩功能减少人体从外界带入的尘埃等污染物。要求缓冲间需3-5平方米，应保持清洁无菌；有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；1-2盏紫外灯定时照射，对衣物及空间进行灭菌。基本设备3.无菌操作室（区）主要用于植物材料的消毒、接种等是植物组织培养研究中最关键的部分分区：准备室接种室：定期消毒，甲醛和高锰酸钾蒸汽熏蒸目前，大多数实验室采用超净工作台代替基本设备3.培养室基本设备4.

4、用具培养瓶广口瓶三角瓶量筒烧杯容量瓶移液管培养皿试管镊子解剖针接种针剪刀用具的洗涤：1.玻璃器皿的消毒1）新购置，用1%稀HCL浸泡一夜，肥皂水洗净，清水冲洗，蒸馏水冲洗一遍2）用过，清水冲洗，蒸馏水冲洗一遍，干后备用3）已污染，高压蒸汽灭菌30min2.金属器皿的消毒擦净油腻，热肥皂水洗净，清水冲洗，擦干备用用具的灭菌高温灭菌：干热灭菌高压蒸汽灭菌４、培养室功能接种的材料进行培养生长的场所（其设计以充分利用空间和节省能源为原则）。要求：能控制光照和温度保持相对的无菌环境有排风窗和换气扇等培养室的换气装置有适宜的培养架，日光灯照明。主要设备培养架、培养箱、空调机、

5、除湿机、换气扇、臭氧发生器等。小型臭氧发生器二、培养器皿及用具1、培养器皿（包括玻璃器皿和塑料器皿）各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。2、微孔过滤器（细菌过滤器）0.45微米，抽滤灭菌用，如激素3、器械用具镊子、剪刀、解剖刀、接种针（铲）等。第二节　培养基及其配制定义：培养基(culturemedium)——根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的人工制作的营养物质。是植物组织培养的重要基质。不同植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官找到一合适的培养基，是培养成功的基

6、础。一．培养基成分主要为：水无机盐有机化合物生长调节物质１．水水是植物体的重要组成成分，是一切代谢过程的介质和溶媒，是生命活动过程中不可缺少的物质。培养基大部分是水（固体培养基约75—80%）天然水或自来水不能直接用于培养基配制原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用双蒸水或超纯水。大批量快速繁殖培养，可用单蒸水或纯净水。保持母液及培养基成分的精确性防止贮藏过程发霉变质２．无机盐类(inorganicelement）离体组织生长发育的基本成分，根据植物对必需元素需要的量，可以分为：大量元素微量元素大量元素指植物所需元素的浓度大于0.5mmol／L的元素，有C、

7、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。除C、H、O外，其它矿质元素通常以一定浓度的无机化合物形式，按一定比例配制而成，溶于水中以离子态被吸收N有硝态氮KNO3和铵态氮(NH4)2SO4两种形式（一般NH4—N对植物生长较为有利）。微量元素浓度小于0.5mmol／L的元素，有Fe、Cu、Zn等。铁盐在合成叶绿素中起重要作用，缺铁影响到胚的发育，阻碍子叶变绿。3.有机化合物(organiccompound)[基本培养基（只含有大量和微量元素）]为使培养物的生长更好，还需添加各种有机成分：糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等（１）糖类（碳水化合物）碳源，维持培养基的渗透压在

8、1.5-4