上课血红蛋白的提取和分离ppt课件.ppt

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1、1蛋白质分离的原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。一、基础知识2凝胶色谱法（分配色谱法）1、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。性质：微小的多孔球体本质：多糖类化合物实例：葡聚糖、琼脂糖3提取分离方法凝胶色谱法凝胶电泳法4凝胶色谱法分离蛋白质56相对分子质量大小直径大小大于凝胶颗粒孔道直径小于凝胶颗粒孔道直径运动路径被阻挡在凝胶颗粒外面而迅速通过因扩散进入凝胶颗粒内部而被滞留运动速度较快较

2、慢运动路程较短较长洗脱次序先后2、凝胶色谱法的原理7（二）缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。1、作用:2、缓冲溶液的配制:通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。8（二）缓冲溶液3、在本课题中使用的缓冲液是：磷酸缓冲液成分：NaH2PO4/Na2HPO49（三）电泳：1、概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。102、原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相

3、反的电极移动。③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。113、类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。12聚丙烯酰胺凝胶电泳在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应13蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多

4、少以及分子的大小等因素。14SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。SDS作用机理:15实验操作步骤1、样品处理2、粗分离3、纯化4、纯度鉴定16水分血浆固体物质血液白细胞血细胞血小板红细胞血红蛋白（90％）血液有哪些成分？17血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此

5、基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：181、红细胞的洗涤2、血红蛋白的释放3、分离血红蛋白溶液4、透析（一）样品处理19问题：1、刚采集的血样要做怎样的处理？为什么？加入抗凝血剂，防止血液凝固。2、怎样洗涤？采样分离－吸浆倒红－加液搅拌－重洗三次低速短时间离心生理盐水1、红细胞的洗涤203、洗涤的目的是什么？去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。4、洗涤干净的标志是什么？直至上清液不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。1、红细胞的洗涤212、血红蛋白的释放问题：加蒸馏水和甲苯的作用是什么？使红细胞破裂，释放出血红蛋白

6、。22有机溶剂（无色透明的甲苯层）脂类物质（白色脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液（红色透明液体）红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀物）3、分离血红蛋白溶液高速离心－滤纸过滤－漏斗分液23血红蛋白24(4)透析：①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。25262.凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作：27（2）凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分

7、离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。②凝胶的前处理：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。28③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。（2）凝胶色谱柱的装填29④洗涤平衡：注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的

8、分离效果。