《血红蛋白的提取和分离》ppt课件.ppt

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1、1、课题学习目标：简述蛋白质提取和分离的基本原理，并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。2、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法3、课题难点：①样品的预处理②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。思考：1、分离生物大分子的基本思路是什么？2、蛋白质的分离和提取的原理是什么？1、分离生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。2、蛋白质分离和提取的原理根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。一、基础知识3、提取分离方法凝胶色谱法凝胶电泳

2、法（一）凝胶色谱法（分配色谱法）2.凝胶大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。1.概念3.凝胶色谱法的原理①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。③依据的特性是：蛋白质分子量的大小。4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示分离过程：混合物上柱洗脱大分子流动快小分子

3、流动慢收集大分子收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。1、用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质()A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快即时应用：D2、相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个（）B1、什么是缓冲液？2、缓冲液的作用是什么？思考：3、缓冲液是如何配制的？你所学过的人体血液的缓冲物质有哪些？4、本实验加的是什么缓冲液？为何要加缓冲液？（二）缓冲溶液1.概念:在一定的范围内，凡是能够抵制外界的酸或碱的影响使原来溶液PH基本保持不变的混合溶液。能

4、够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。2.作用:思考：说出人体血液中缓冲对。NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成,调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。3.配制：（二）缓冲溶液（二）缓冲溶液1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2.原理：①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③分离样品中各种分子,带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子

5、产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。（三）电泳：影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向形成库仑力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√√√√3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动琼脂糖凝胶电泳示意图1、测定蛋白质分子量:常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联）丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联

6、共聚反应聚丙烯酰胺凝胶电泳:蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。2.原理：SDS能使蛋白质发生完全变性。解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。3.SDS作用机理:3.使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异即时应用：二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定（一）蛋白质提取和分

7、离步骤（二）操作过程1.样品处理：可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。思考:1.用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血红蛋白两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子O2或一分子CO2，血红蛋白因含有血红素而呈红色。血红蛋白的特点：血液血浆水分固体物质：血浆蛋白、无机盐、磷