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时间:2020-03-14
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1、1一、血红蛋白的提取和分离1、血液有哪些成分血液血浆水分固体物质:血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞(最多)血红蛋白(90%)两个α-肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团2血红蛋白两个α-肽链两个β一肽链四个亚铁血红素基团每个肽链环绕一个亚铁血红素基团,此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳,血红蛋白因含有血红素而呈红色。2、血红蛋白的特点:33、蛋白质分离和提取的原理:根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等,可以用来分离不同种类的蛋白质。4、蛋白质分离和提取的常用方
2、法:①凝胶色谱法(分配色谱法)②电泳4(一)凝胶色谱法(分配色谱法)1.概念:根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小,利用具有网状结构的凝胶,来进行分离。2.凝胶:大多数凝胶是由多糖类化合物(如葡聚糖或琼脂糖)构成的多孔小球体,内部有许多贯穿的通道。53.凝胶色谱法的原理①当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢;②而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。③依据的特性是:蛋白质分子量的大小。6凝
3、胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示7(二)缓冲溶液1.概念:2.作用:在一定的范围内,凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响,维持PH基本不变。83.缓冲溶液的配制:通常由1-2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。4.提问:在本课题中使用的缓冲液是:__________,其目的是:利用缓冲液模拟细胞内的PH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察(红色)和科学研究(活性)。磷酸缓冲液9样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品
4、处理:(一)蛋白质提取和分离步骤(二)操作过程本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来分离血红蛋白。二、实验操作10(1)红细胞的洗涤:去除杂蛋白,以利于后续血红蛋白的分离纯化,洗涤次数不可过少。1、采集血样。2、低速短时间离心(速度越高和时间越长,会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀,达不到分离的效果)3、吸取血浆:上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤:用五倍体积的质量分数为0.9%的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心(低速短时间)6、重复4、5步骤三次,直至上清液中已没有黄色,表明洗涤干净。①洗涤目的:②洗涤操作:11(2)血红蛋白的释放:加蒸馏水到原血液体积
5、,再加40%体积的甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟(加速细胞破裂),细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液:①过程:将搅拌好混合液转移到离心管内,2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次:第1层(最上层):甲苯层(无色透明);第2层(中上层):脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体);第3层(中下层):血红蛋白的水溶液层(红色透明液体);第4层(最下层):杂质沉淀层(暗红色)。③分离:用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层,于分液漏斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。12甲苯层(无色透明)白色薄层固体红色透明液体杂质沉淀层(暗红色)试管
6、中溶液层次13(4)透析:①过程:取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中(pH为7.0),透析12小时。②透析目的:除去样品中分子量较小的杂质。14透析过程动画演示152.凝胶色谱操作:①取长40厘米,内径1.6厘米的玻璃管,两端需用砂纸磨平。②底塞的制作:打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网,再用100目尼龙纱包好,插到玻璃管的一端。16③顶塞的制作:打孔→安装玻璃管。④组装:将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构17(2)凝胶色谱柱的装填①凝胶的选择:A、材
7、料:交联葡聚糖凝胶(G-75)。B、代表意义:“G”表示凝胶的交联程度,膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值,即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。②凝胶的前处理:配置凝胶悬浮液:计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后,配成凝胶悬浮液。18③凝胶色谱柱的装填方法:A、固定:将色谱柱装置固定在支架上。B、装填:将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内,装填时轻轻敲动色谱柱,使凝胶填装均匀。注意:1、凝胶装填时尽量紧密,以降低凝胶颗粒之间的空隙。2、装填凝胶柱时不得有气泡存在:因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离效果。19④洗涤平衡:装填
8、完毕后,立即用缓冲液洗脱瓶,在50cm高的操作压下,用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液
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