资源描述：
《环介导等温扩增技术.ppt.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、环介导等温扩增（LAMP）检测金黄色葡萄球菌摘 要:建立一种能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的LAMP方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性和灵敏度的检测并与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为61℃,只对金黄色葡萄球菌进行扩增;灵敏度高,金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为8～9cfu/mL时仍能检出。LAMP方法检测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄球菌的新方法。简介：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus
2、)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是引起奶牛患乳房炎的重要病原菌,在自然界中广泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin—resistantStaphylococcusaureus,MRSA)大量出现。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是引起食物中毒的主要原因,每年都有肠毒素中毒的报道,已经成为世界性的卫生问题。因此建立快速、简便地检测金黄色葡萄球菌的方法一直是研究的热点。目前,金黄色葡萄球菌的检测方法有很多,主要有分离培养法、琼脂扩散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、测试片
3、法、PCR法等。环介导恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是Notomi等2000年发明的一种新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,在DNA聚合酶(BstDNApolymerase)的作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的速度。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中,如巴西芽生菌、锥虫病、沙门氏菌、虾中的白斑综合症病毒、志贺氏菌属和大肠杆菌。本研究针对金黄色葡萄球菌的femA基因设计一套L
4、AMP引物,对金黄色葡萄球菌进行检测,优化反应条件,确定检测特异性,对lamp法与PCR法的灵敏度进行了对比。LAMP的技术原理：LAMP方法的特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件(60～65℃)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应,直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断是否发生反应。短时间扩增效率可达到10^9～10^10个拷贝。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。材料与方法材料与仪器材料：金黄色葡萄球菌(Staphylococ
5、cusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、沙门氏菌(Salmonellaenterica)、沙门氏菌(Salmonellasp)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescence)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，沙门氏菌(SalmonellaHJ-004)、志贺菌(Shigellaspp)、单增李斯特菌(Listeriammonocytogenes)、大肠杆菌(Escherichiacoli)ETEC:44247(6:15
6、:16)、EPEC:44706(111:58)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、嗜热链球菌(StreptococcusthermophilusKLDS)、双歧杆菌(LactobacillusbifidusKLDS)，BstDNA聚合酶(NewEnglandBiolab)、DNAmarkerDL2000仪器：DYY-10C型电泳仪UVP凝胶成像仪2.实验方法
7、⑴DNA模板的制备煮沸法将对数生长期的金黄色葡萄球菌等细菌培养物,取1mL于EP管中12000r/min,离心5min收集菌体,加入TE-Trinton200μL混匀后,于沸水中5min,后12000r/min离心5min,取上面50μL作为LAMP扩增及PCR扩增反应的模板。另用试剂盒提取标准金黄色葡萄球菌DNA备用。⑵引物的设计与合成根据金黄色葡萄球菌femA基因,应用PrimerExplorer3设计特异引物,包括两条外引物F3、B3,内引物FIP、BIP。⑶LAMP反应及条件的优化①LAMP反应：配置反应体系为25μL,包括:01
8、8mmol/LFIP,018mmol/LBIP,012mmol/LF3,012mmol/LB3,116mmol/LdNTPs,018mmol/Lbetaine,4mmol/LMgSO4,20m
